Геном человека,структура генов
Рефераты >> Медицина >> Геном человека,структура генов

Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона,где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюдается, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окруженного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами и интронами имеются консервативные канонические последовательности, играющие существенную роль в обеспечении точности вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчиваются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная последовательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с одного и того же первичного РНК транскрипта.

Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспечивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и ответственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимераза II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспортных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связывается с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами. После того как первый нуклеотид РНК инкорпорируется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала,представляющего собой один или несколько терминирующих кодонов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс контролируется промотором - специальной регуляторной последовательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной,как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под контролем одного промотора считывается несколько генов c образованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные области различных генов довольно разнообразны по своему нуклеотидному составу. Однако, почти для всех промоторов характерно наличие консервативной последовательности из 7 оснований на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хогнесса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимеразы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 – 80 п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто расположена другая консервативная последовательность из 9 п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут существенно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала его кодирующей части располагаются другие регуляторные последовательности, так называемые инхансеры (усилители),способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличения скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут работать независимо от их ориентации по отношению к сайту инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавляющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (ослабители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать продвижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции,трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти механизмы более детально рассмотрены в других разделах.

Раздел 5 .Изменчивость генома, полиморфные сайты рестрикции, ПДРФ-анализ.

Кодирующие и регуляторные области структурных генов наиболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора.Действительно, небольшие изменения в этих последовательностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза белка или к потере его функции, что, как правило, драматическим образом сказывается на жизнеспособности особей, несущих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, подобных сателлитным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным промежуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репродуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа родословных можно проследить их наследование в ряду поколений, проанализировать сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть использовать в качестве обычных менделевских признаков в классическом генетическом анализе. Информативность полиморфных локусов определяется уровнем их генетической изменчивости в различных популяциях.

Экспериментально легко выявляются два варианта геномного полиморфизма. Количественые изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появлению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае изменчивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генетического кода могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре-зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом,при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на 300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и использован для молекулярной маркировки специфических участков генома исторически раньше по сравнению с вариабильными сателлитными повторами (Botstein et al.,1980).Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну.При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рестрикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализации используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рестрикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рестрикци. Однако, такие зонды очень редко используются на практике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда удается выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий полиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую длину. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фрагменту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины. У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,один из которых по длине будет соответствовать размеру амплификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использования для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возможным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.


Страница: