Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хромосому образует блок из множества тандемно расположенных копий, при этом число единиц повтора в блоке у разных особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генетические конструкции устойчивы и стабильно передаются потомству в соответствии с законами Менделя. Встраивание введенной ДНК в функционально значимые области генома может приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом,животные, полученные при введении одного и того же гена, будут различаться как по сайтам интеграции, так и по количеству копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях,по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле уникально.

Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обьектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введенного гена у животных, различающихся по длине фланкирующих последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность обнаружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последовательностей гена часто вводят генетические конструкции, сочетающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой ферментативной активности. Использование для трансгеноза рекомбинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комбинации регуляторных элементов и кодирующих последовательностей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механизмов активации генов в разных типах тканей.Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже-родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отклонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с уже известными наследственными нарушениями у человека и подобные животные также могут использоваться в качестве гене-тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологические модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несовершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно (Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение дополнительной дозы экспрессирующего гена приводило к нарушению балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следствие этого, было причиной патологических процессов.

Раздел 3. Экспериментальное моделирование.

Другой вариант биологического моделирования основан на получении животных с определенными очень специфичными, но ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько примеров подобного экспериментального моделирования.Описанная технология трансгеноза (введение генов в пронуклеус) может быть использована, в частности, для направленного получения животных с избирательными дефектами (уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключается в возможности селективной элиминации тех специфических типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержащей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерийного токсина, находящийся под контролем работающих в определенных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При активации этих контролирующих элементов на определеной стадии развития экспрессия токсического гена приводит к избирательной гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая система действует как очень точный скальпель.

Дальнейшая модификация метода заключается в использовании для трансгеноза условно летального гена, каким является,например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормально. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно вызвать их селективную гибель при введении животному ганцикловира - противогерпесного препарата. Эта система дает больше возможностей для экспериментального анализа роли специфических клонов клеток в процессе нормального развития, а также для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью этих клеток. Подобная методология используется также при разработке генотерапевтических подходов для лечения некоторых ненаследственных, в частности онкологических заболева-ний.Весьма многообещающим методом моделирования представляется направленное выключение работы определенных генов путем введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.Такой подход был применен, в частности, при попытке моделирования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловленного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, является само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.

Другой пример экспериментального моделирования основан на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у таких животных может происходить дифференцировка трансплантированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пересаженных кусочков тканей из различных органов других видов животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют структуру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариантов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эффективности коррекции этого генетического дефекта с помощью методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпителиальные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, несущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК нормального гена муковисцидоза. Относительная простота подобных моделей и возможность генетического манипулирования с клетками человека до их трансплантации атимусным мышам делают этот подход весьма привлекательным для решения многих экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моделей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии животных в этом отношении имеют значительные преимущества.

Раздел 4. Конструирование модельных генетических линий животных.

Современный уровень экспериментальной эмбриологии млекопитающих и современные достижения молекулярной генетики позволяют осуществлять направленное получение генетических моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфических модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный качественный прорыв в генетическом моделировании стал возможен благодаря появлению принципиально новой технологии манипулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно важными в этом отношении оказались два новых методических подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии культивирования клеточных векторов, так называемых эмбриональных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой стороны, появились методы сайт-специфического переноса клонированных последовательностей ДНК в геном эукариот, основанные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфекции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности ДНК в месте встраивания.