*при наличии гемолиза необходимо из результатов определения общего содержания белка вычесть эксперименталыю установленную поправку на степень гемолиза: при " l " - 0,6 -0,7; при "++" 1,2 - 1,4; сильногемолиэированная сыворотка для определения общего содержания белка использована быть не может. 8. Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ) Показатель среднего содержания гемоглобина в одном эритроците очень важен для выявления гипо- и гиперхромачии. СГЭ в одном эритроците принято выражать в пикограммах (синоним - микромикрограмм); 1 пг- КГ12 г.

8.1. Ход определения и учет результатов.

СГЭ в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в грамм-процентах, на число эритроцитов в этом же объеме. Для упрощения расчетов можно разделить содержание гемоглобина, выраженное в г/л, на число эритроцитов в миллионах.

9. Определение среднего объема эритроцитов

Для выяснения наличия микро- и макроцитозов наряду с непосредственным измерением размеров эритроцитов на мазках удобнее вычислять средний объем эритроцитов косвенно, который выражают в кубических микрометрах (мкм3).

9.1. Ход определения и учет результатов.

Для определения среднего объема эритроцитов показания гематокритного числа делят на число эритроцитов в 1 мкл крови.

Практически средний объем эритроцитов определяют по формуле:

А х 1000/Б,

где: А - гематокритное число, л/л ; Б - число эритроцитов , млн /мкл .

10. Определение скорости оседания эритроцитов

В зависимости от физических и химических свойств крови эритроциты оседают в микрокапиллярах с различной скоростью. Скорость оседания эритроцитов определяется в аппаратах Панченкова и выражается в миллиметрах за 1 ч (мм/ч).

10.1. Оборудование и реактивы:

- часовое стекло,- аппарат Панченкова, состоящий из штатива и специальных капиллярных пипеток, на которых нанесена миллиметровая шкала длиной К) см; верхнее деление шкалы отмечено буквами О и К (кровь), против деления 50 имеется буква Р (реактив), - профильтрованный 5-% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия.

10.2. Ход определения и учет результатов.

Промывают капиллярную пипетку раствором лимоннокислого натрия, затем набирают этот раствор до метки Р и выливают его в часовое стекло. Тем же капилляром набирают кровь 2 раза до метки К и спускают в часовое стекло. Хорошо перемешивают и, набрав смесь в капилляр до метки К, ставят в штатив на ! ч. По истечении этого времени определяют скорость оседания эритроцитов. Величину столбика плазмы, освободившегося от эритроцитов, учитывают по делениям на капиллярной пипетке.

При работе с молодью рыб допускается набирать меньший объем крови (1/2 или 1/4 К), при этом соотношение лимоннокислого натрия и крови необходимо строго сохранять на уровне 1:2.

11. Оценка эритроцитарной картины крови рыб

По соотношению молодых и зрелых форм эритроцитов оценивают активность эритропоэза. Соотношение эритроцитов выражают в процентах (%).

11.1. Оборудование:

- микроскоп,

- окрашенные мачки крови (см. п. 3.),

- иммерсионное масло.

11.2. Ход определения и учет результатов. Под микроскопом на мазке крови просматривают нс менее 1000 эритроцитов при увеличении х 630 (под иммерсией). Клетки идентифицируют, используя "Атлас клеток крови рыб" (Иванова, 1983) и выводят процент различных стадий созревания эритроцитов по формуле:

Х =• (А х 100)/1000= А х-0,1%,

где: А - число незрелых эритроцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов; Х - искомый процент незрелых эритроцитов.

12. Определение общего числа лейкоцитов

Лейкоциты, как клетки белой крови рыб, выполняют разнообразные физиологические и иммунологические функции. Они участвуют в регенерации поврежденных тканей, разрушении чужеродных тел, синтезе белка и антител, инкапсуляции паразитов и т.д. Существует непрямой (косвенный) и прямой способ учета лейкоцитов в периферической крови рыб. Число лейкоцитов выражают в 1 мкл крови (тыс. шт. / мкл).

12.1. Косвенный метод

12.1.1.Оборудование:

- микроскоп,

- окрашенные мазки крови (см. п. 3),

- иммерсионное масло.

12.1.2. Ход определения и учет результатов. Определяют число лейкоцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов в мазке крови, и затем пересчитывают их количество на 1 мкл по формуле:

Х = (А х В)/1000,

где: Х - общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А - число эритроцитов в 1 мкл крови, определенное в камере Го-ряева: В - число лейкоцитов, определенное при подсчете 1000 эритроцитов на мачке крови.

12.2. Прямой метод подсчета количества лейкоцитов 12.2.1

12.2.1. Подготовка к исследованию.

Приготовления растворов А и В

- 25 мг нейтральрота и 0,6 г натрия хлористого растворяют в 100 мл дистиллированной воды ( раствор А можно использовать одни сутки);

- 12 мг кристаллвиолета, 3,8 мг натрия цитрата и 0,4 мл формалина растворяют в 100 мл дистиллированной воды (раствор В использовать около недели).

12.2.2. Оборудование и реактивы:

- микроскоп,

- счетная камера форменных элементов крови,

- смеситель для подсчета эритроцитов млекопитающих,

- пастеровские пипетки - стерильные,

- часовое стекло,

-2 -% раствор натрия цитрата,

- растворы А и В.

12.2.3. Ход определения и учет результатов.

Взятие крови производят в соответствии с п.2 настоящих Методических указаний. Кровь из часового стекла набирают в смеситель для подсчета эритроцитов млекопитающих до метки 0,5 или 1. Кончик смесителя вытирают ватой, набирают в смеситель раствор А до половины расширения смесителя, затем до метки 101 заполняют раствором Б.

Если кровь набирают до метки 0,5, то получается разбавление в 200 раз, если до метки 1 - в 100 раз.

После наполнения со смесителя снимают резиновую трубку, зажимают его между большим и средним пальцем и перемешивают кровь с разбавляющей жидкостью. Смеситель оставляют в горизонтальном положении на 5-10 минут, затем вновь перемешивают. Первые 2-3 капли, выходящие из смесителя, стряхивают и только следующей каплей заряжают счетную камеру. Покровное стекло должно быть заранее притерто к счетной камере до появления колец Ньютона. Под действием растворов А и В происходит витальная окраска форменных элементов крови. Ядра лейкоцитов окрашиваются в темный фиолетово-красный цвет, а протоплазма - в розовый. В эритроцитах слабо окрашиваются только ядра. Благодаря этому эритроциты и лейкоциты различимы в камере.

Количество лейкоцитов подсчитывают в 80 больших квадратах и определяют их количество по формуле:

x=mx250xУ/п, гдe:

Х - число лейкоцитов в 1 мкл,

М- общее количество клеток в подсчитанных квадратах,

У - степень разбавления крови,

п - число просмотренных квадратов.

13. Выведение лейкоцитарной формулы.

Для характеристики лейкоцитозов и лейкопений, возникающих у рыб при различных заболеваниях, используют дифференциальный подсчет лейкоцитов, то есть выводят лейкоцитарную формулу. Количество различных групп лейкоцитов выражают в процентах (%).