Нитрил и аминофазы применяют в биологии, медицине, биохимии, фармакологии и др. (рис. 2). Эти фазы нашли наиболее широкое признание и выпускаются почти всеми производителями сорбентов Некоторые фирмы выпускают варианты аминофаз, содержащие, например, диэтиламиноэтильные или диметиламино-пропильные группы.

Достаточно широко применяют также еще одну привитую полярную фазу — так называемую «диольную», или просто «диол», которая содержит в составе привитой группы две гидроксильные группы. Ее селективность также будет несколько отличной из-за другой химической природы полярных групп. Сорбенты с такими привитыми фазами выпускают значительно меньшее число производителей.

Сорбенты с другими привитыми полярными группами (за исключением ионообменников) выпускаются еще меньшим числом фирм или же всего одной-двумя, а их применение также достаточно редко. Это связано с тем, что какая-то особая селективность, оправдывающая их применение (рис. 2.6), отмечается довольно редко. С чем же связано то, что многие привитые полярные фазы разных типов, которые были разработаны и даже производились, не приобрели заметной популярности? Ведь в ГЖХ этот путь является основным, позволяющим добиться разделения на колонке — новая фаза с особыми свойствами, дающая высокую селективность.

Рис. 3. Хроматограмма моносахаридов, полученная на колонке размером 250x4,6 мм с полигосилом 60 NH2 (5 мкм), подвижная фаза —ацетонитрил — вода (75:25 по объему), расход 2 мл/мин, детектор — УФ (190 нм): 1 — рамноза; 2 — ксилоза; 3 — арабиноза; 4 — фруктоза; 5 — манноза; 6 — глюкоза; 7 — галактоза

Рис. 4. Хроматограмма цитохромов Ц разного происхождения, получен-ная на колонке размером 250х4 мм с нуклеосилом CN (5 мкм), подвижная фаза — 0,05 М раствор сульфата натрия в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 2,0) — ацетонитрил (77,5:22,5 по объему), расход 1 мл/мин, детектор — УФ (400 нм): 1 — лошади; 2 — быка; 3 — собаки; 4 — тунца

Рис. 5. Хроматограмма полициклических углеводородов, полученная на колонке размером 150x4,6 мм с нуклеосилом NO2 (5 мкм), подвижная фаза — изооктан, расход 1,4 мл/мин, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл:

1 — бензол; 2 — нафталин: 3 — фенантрен; 4 — флюорен; 5— пирен; 6 — 1,3,5 -трифенилбензол; 7 — хризен

Главная причина в том, что в ГЖХ молекулы разделяемого вещества вступают во взаимодействие с неподвижной фазой непосредственно, а в ВЭЖХ — только через молекулы сольватированного растворителя, которого тем больше (а влияние привитой группы — слабее), чем больше сольватирующие способности растворителя и сольватируемость полярных групп привитой фазы. Хотя природа привитых полярных групп (нитрил, амин, диол) заметно различается, нивелирующее действие сольвата-ционных оболочек сглаживает эти различия. Поэтому улучшение разрешения заменой сольватирующей полярную группу молекулы или группы молекул на новую путем модификации состава растворителя, введения новых компонентов растворителя или добавок к нему (при сохранении той же привитой полярной группы) часто не только проще для хроматографиста, но и дает существенно более значимый результат.

Обращенно-фазная распределительная хроматография с привитыми фазами

Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбент с привитыми неполярными (как правило, длинными алкильными или алкилсилильными) группами и полярный растворитель, например водный метанол, получил название обращенно-фазной ВЭЖХ. Этот не совсем удачный термин, указывающий на перемену полярности неподвижной и подвижной фаз на противоположные в данном варианте ВЭЖХ прижился и стал общепринятым, означающим: подвижная фаза полярна, неподвижная — неполярна. В отличие от недостаточно удачного названия сам метод оказался настолько удачным, что в настоящее время является основным в ВЭЖХ. По общим оценкам, каждые два разделения из трех, появляющихся в литературе и используемых в практической работе, относятся к обращенно-фазной ВЭЖХ в ее разных вариантах, т.е. 60—70% работы в данное время проводят этим методом. В чем же причина такой популярности обращенно-фазной хроматографии, что на все остальные варианты ВЭЖХ (адсорбционную, распределительную нормально-фазную, ионообменную, эксклюзионную и другие) приходится менее одной трети применений?

Причин таких несколько, и каждая сыграла роль в широком использовании метода обращенно-фазной ВЭЖХ. Были разработаны и быстро внедрены в производство сорбенты для этого метода, имеющие привитые алкилсилильные группы разной длины (от С2 до Саг с прямой алкильной цепью, фенильной и ди-фенильной группами). Растворители, используемые для этого метода (ацетонитрил, метанол, вода, в меньшей мере — тетра-гидрофуран), позволяют работать в широком УФ-диапазоне, так как они УФ-прозрачны со 190-210 (ТГФ — с 220) нм. Это позволяет применять наиболее популярный детектор — УФ-спектрофотометр как при 190-210 нм, где он детектирует неселективно, и поэтому приближается к универсальному детектору (анализ Сахаров, жиров, сложных эфиров, спиртов, олефинов), так и при любой длине волны, обеспечивающей селективное детектирование (например, витамина А при 325 нм). Растворители, используемые в обращенно-фазных разделениях, относительно легко растворяют практически все важнейшие группы веществ, находящихся в организме человека, биологических объектах, используемых в виде лекарственных препаратов, пестицидов, гербицидов широко используемых в органической химии, нефтехимии, биоорганической химии (рис. 2.7-2.10). Сорбенты в обращенно-фазной ВЭЖХ быстро приходят в равновесие

Рис. 7. Хроматограмма смеси ароматических углеводородов, полученная на колонке размером 250х4,6 мм с зорбаксом ОДС (6 мкм), подвижная фаза — метанол — вода (90:10 по объему), расход 1,5 мл/мин, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл: 1 — толуол; 2 — о-ксилол; 3 — трет-бутилбензол; 4 — n-трет-бутилтолуол; 5 — n-трет-амил-толуол; 6 — n-трет-гексилтолуол; 7 — 3,5-ди-трет -бутилтолуол; 8 — трет-гексил-о-ксилол

Рис. 8. Хроматограмма натурального кофе, полученная на колонке размером 150х4,6 мм с нуклеосилом С8 (5 мкм), подвижная фаза — метанол — 0,01 М фосфатный буферный раствор с рН 7,0 (20:80), расход 1,2 мл/мин, давление 12 МПа, температура 25 °С, детектор Уф (280 нм), проба 20 мкл: 1 — кофеин

с новыми растворителями и при изменении состава растворителя, что позволяет переходить от одной методикики к другой с использованием одной и той же колонки, а

также широко применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителем.

Сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы).