При изменении ионной формы смолы или в присутствии органических растворителей, таких, как ацетонитрил, тетрагидрофуран, может изменяться и объем смолы. Если смола уменьшается в объеме, упаковка в колонке оседает и образуется мертвый объем наверху колонки. Это оседание сопровождается потерей эффективности. Если смола набухает и упаковка в колонке увеличивается, то возрастает сопротивление в колонке, значительно уменьшает скорость потока и может даже привести к разрушению

сорбента. Невысокая стабильность ионогенных материалов является одним из недостатков ионообменной хроматографии, причем анионообменники менее стабильны, чем катионообменники. Для увеличения срока службы колонок используют предколонки, а также регенерацию колонок сильным растворителем. Катиониты, например, регенерируют обрабатывая 1 М азотной кислотой и продолжительно промывая той подвижной фазой, которая будет использована.

Ионообменники характеризуются степенью набухания и емкостью. Степенью набухания называют объем упакованного в колонну обменника (в мл), приходящийся на 1 г его в сухом виде, и имеет размерность мл/г. Максимальное количество ионов, которое может связать ионообменник, определяет его емкость, которая совпадает с концентрацией ионогенных групп. Ёмкость выражается числам ммоль эквивалентов обмениваемого иона на 1 г сухого обменника (ммоль экв/г) или на 1 мл упакованного в колонну набухшего ионообменника (ммоль экв/мл) при значениях рН, соответствующих его полной ионизации. Для высокомолекулярных ионов или амфолитов, например белков, вводят понятие «эффективная» емкость, кoтоpaя зависит от размера молекулы амфолита, расстояния между ионогенными группами и степени доступности всего объема пористой матрицы обменника для этих молекул. Понятия емкости и эффективной емкости могут не совпадать. Иногда приходится снижать полезную емкость сорбента за счет изменения рН, увеличивая при этом его эффективную емкость. Катионообменные смолы имеют емкость около 4,4 ммоль экв/г, а анионообменные – 3,5–4 ммоль экв/г для гелеобразной структуры и 2,5 ммоль экв/г для пористой. Обменная емкость изменяется при изменении рН. При низких рН происходит нейтрализация катионита при добавлении протона:

R-+H+ ↔ R-H+,

а при высоких рН подобным образом при действии щелочи нейтрализуются аниониты:

R++OH- ↔ R+OH-.

Поскольку ионообменная емкость сильных катионитов падает до нуля при низких рН, они не могут быть использованы при рН<1. Сильные аниониты должны применяться при рН<11, слабые катиониты при рН>6, а слабые аниониты при рН<8. Из рисунка видно, что сильные ионообменники могут быть использованы в более широком диапазоне рН, чем слабые. Этим объясняется широкое применение сильных ионитов, на которых может быть разделено большее количество веществ разных классов одновременно, особенно если используется градиентное изменение рН. Сильно удерживаемые вещества, нестойкие при крайних зна чениях рН, могут разделяться на слабых ионитах. Еще раз подчеркнем, что сильные иониты полностью ионизированы в диапазоне рН=2–11. Слабые иониты полностью ионизированы в ограниченной области рН, и их ионизацией можно управлять, меняя рН элюента в пределах диапазона рабочих значений рН.

Таким образом, к категории слабых могут быть отнесены ионообменники, значительно отличающиеся друг от друга. Для них характерно не толыко сужение рабочего диапазона рН, но и уменьшение прочности сорбции вещества внутри этого диапазона. Слабым ионообменникам, в частности анионитам с замещающими группами диэтиламиноэтила (ДЕАЕ), отдают предпочтение в тех случаях, когда необходимо элюирование в мягких условиях, например, при разделении белков и пептидов.

Наибольший интерес в качестве сорбентов для ионообменной хроматографии представляет химически модифицированный силикагель, получаемый прививкой к силикагелю ионогенных групп.

Таблица 1. Характеристика модифицированных силикагелей и ионообменных смол

Применение этих материалов значительно увеличивает стабильность работы колонок, в которых не происходит изменения эффективности. Однако сильнокислые или сильноосновные среды (2>рН>7,5) могут воздействовать на силикагель, выводя из строя колонку. Привитые к силикагелю ионообменники могут быть нестабильны при действии органических растворителей, концентрированных буферных растворов, высоких температур. Ионообменные силикагели зернением 10 или 5 мм не набухают, не сжимаются, как смолы, и отличаются от них большИМ размером и доступностью внутренних пор как для ионов образца, так и для противоионов. Благодаря этому быстрее устанавливается массоперенос даже без повышения температуры и значительно возрастает эффективность сорбента.

Не существует слабых катионитов на основе силикагеля, так как при рН<8 материал не ионизирован, а при рН>8 разрушается подложка наполнительного материала. Сравнительные характеристики модифицированных силикагелей и ионообменных смол, применяемых в ионообменной хроматографии, даны в табл. 1.

Выбор подвижной фазы и условий разделения

Подвижная фаза в ионообменной хроматографии должна обеспечивать растворимость различных солей и создание буферного раствора, необходимых для ионного обмена, контроль степени удерживания образца за счет использования растворителя нужной силы, получения необходимой селективности разделения.