Антиатеросклеротическое действие смеси масел льна и расторопши с селенопираном
Реакционную смесь перемешивают и инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре (20-25°С) и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 505 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света. (таблица).
Расчет концентрации триглицеридов проводят по формуле:
С = [Ео/Ест *250] – 10 (мг/100мл) или С = [Ео/Ест *2,85] – 0,11ммоль/л
Ео и Ест – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы. 10 мг/100мл (0,11ммоль/л) – поправка на содержание свободного глицерина в сыворотке (плазме крови).
2.3.5. Определение концентрации ХС-ЛВП (холестерина-липопротеидов высокой плотности) (HDL) в сыворотке и плазме крови
ПРИНЦИП МЕТОДА.Хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (LDL) и липопротеиды очень низкой плотности (V LDL) осаждаются при добавлении к образцу фосфовольфрамат/Mg²+. После центрифугирования в супернатанте остаются толькоHDL, концентрация которых определяется так же как концентрация общего холестерина.
Наборреагентов: HDL CHOLESTEROL «FL - E» («Vital-Diagnostics»)
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
1. Преципитация
|
Реагенты |
Опытные пробы, (мл.) |
Калибровочные пробы, (мл.) |
Контрольные пробы, (мл.) |
|
Сыворотка или плазма | 0,15 | _ | _ |
|
H2O | _ | _ | 0,15 |
|
Осаждающий реагент | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
|
Раствор холестерина | _ | 0,15 | _ |
Хорошо перемешать и оставить на 10 мин при комнатной температуре. Опытные пробы отцентрифугировать в течение 10 мин при 4000g или 1-2 мин 1000g. Прозрачный супернатант использовать для определения концентрации HDL. Калибровочные и контрольные пробы центрифугировать не нужно. Определение холестерина во всех пробах в течение часа.
2. Определение концентрации HDL
|
Реагенты |
Опытные пробы, (мл.) |
Калибровочные пробы, (мл.) |
Контрольные пробы, (мл.) |
|
Супернатант | 0,2 | _ | - |
|
H2O+ реагент №1 | _ | _ | 0,2 |
|
Рабочий реагент для определ. холестерина | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
|
Раствор холестерина+реагент №1 | _ | 0,2 | _ |
Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 мин при комнатной температуре (20-25°С) или 5 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.
Расчет концентрации (С) холестерина HDL проводят по формуле:
С = Ео/Ест * 1,29 (ммоль/л) или С = Ео/Ест * 50 (мг/100 мл) Ео и Ест – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.
2.3.6. Определение ХС-ЛОНП (холестерина-липопротеидов очень низкой плотности) расчетным методом
Уровень ХС-ЛОНП находят путем деления показателя концентрации триацилглицеринов на 2,2 (ТГ/2,2). Вывод этой формулы расчетов базируется на том, что, во-первых, при отсутствии в крови хиломикронов (а они после 12-часового голодания у большинства пациентов не выявляются) практически все количество ТГ крови сосредоточено в ЛОНП и ,во-вторых, при не слишком высокой концентрации в крови (когда содержание ТГ не привышает 4,4 ммоль/л) в частицах ЛОНП на 22 молекулы ТГ приходится 10 молекул холестерола [12].
2.3.7. Определение ХС-ЛНП (холестерина липопротеидов низкой плотности) расчетным методом
Зная уровень ХСобщ плазмы, ХС-ЛВП и ХС-ЛОНП, нетрудно определить содержание ХС-ЛНП по формуле [12]:
ХС-ЛНП = ХС - (ХС-ЛВП + ХС-ЛОНП)
2.3.8. Определение индекса атерогенности (ИА) расчетным методом
Расчет индекса атерогенности призводят по формуле:
ХСпл – £-ХС /£-ХС Х (ЭХС/СХС)
ХСпл – общий холестерол плазмы
£-ХС (альфа-ХС) – холестерол супернатанта (ЛПВП)
ЭХС/СХС – отношение содержания эфиросвязанного и свободного холестерола супернатанта плазмы [12] .
2.3.9. Определение содержания диеновых коньюгатов(ДК) в эритроцитах
За основу взят классический метод Placer в модификации Гаврилова В. Б. [9] для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают в пробирках с притертой крышкой с 4 мл чистоперегнанных растворов изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают постоянно не менее одного часа затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через 1-2 часа отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232нм против контрольной пробы (Афон) где вместо гемолизата взято 0,5 мл H2O. Коэффициент экстинции при 233 нм –
2,2 * 10 -5 см-1 М-1. Формула для расчета: С(нмоль/мл эр)= (Аоп - Афон) * 36,4
2.3.10. Определение содержания ДК в плазме крови и гомогенате печени
За основу взят классический метод Гаврилова В.Б. и соавт [9], Владимирова Ю.А. и соавт. [7]. 0,4 мл плазмы вносят в пробирку с плотной крышкой и добавляют 4 мл чисто перегнанной смеси изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают в течение 20-30 мин затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через час отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232 нм против контрольной пробы где вместо гемолизата взято 0,2 мл H2O. Коэффициент экстинции 2,2 * 10 -5 см-1 М-1. Формула для расчета (при l=1 см):
