Оборудование: стрептомицин и соль бензилпенициллина, суспензия культуры В. cereus, пробирки с 10 мл воды для разведений, стерильные пипетки на 1 мл, пробирки с 4 мл питательного агара, бактериологическая петля, спиртовка.

Ход работы:

1. Приготовление серийных разведений антибиотиков.

1.1. Растворили по 1000000 единиц стрептомицина и соли бензилпенициллина (1 г и 0.5 г порошка соответственно) в пробирках с 10 мл воды. Концентрация антибиотиков – 100000 ед./мл.

1.2. Из предыдущего разведения взяли стерильной пипеткой по 1 мл раствора каждого антибиотика и внесли в пробирки с 10 мл стерильной воды.

Концентрация антибиотиков – 10000 ед./мл.

1.3.По приведённой схеме (пункт 1.2.) приготовили разведения антибиотиков с концентрациями – 1000 ед./мл, 100ед./мл и 10 ед./мл.

2. Внесли стерильной пипеткой по 1 мл каждого разведения (10000 ед./мл, 1000 ед./мл, 100 ед./мл, 10ед./мл) в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной и охлаждённой агаризованной среды, скосили пробирки до застывания агара.

3. На поверхность плотной среды петлёй засеяли взвесь культуры B. cereus. Посевы выращивали 18-20 часов.

4. Отметили различную интенсивность роста микроорганизмов при разных концентрациях антибиотика.

Глава 3. Результаты исследований

В ходе курсовой работы изучили влияние таких антибиотиков, как стрептомицин, пенициллин, ампициллин, на грамположительные бактерии рода Bacillus: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus cereus.

Bacillus cereus образовал выпуклые колонии белого цвета с расползающимися краями, блестящие, слизистые; Bacillus subtilis – мутно-белые, слизистые, выпуклые колонии с расползающимися краями; Bacillus mesentericus – прозрачно-серые, плоские, блестящие, слизистые колонии с расползающимися краями.

В результате исследований методом диффузии в агар с использованием желобка получили следующие результаты:

1. В чашке Петри с бензилпенициллином наблюдали задержку роста колоний микроорганизмов, т. е. расстояние от края желобка до начала роста колоний. Задержка роста культуры, Bacillus subtilis составила 2 см, Bacillus mesentericus – 1.5 см, Bacillus cereus - 1 см. Результаты приведены на Рисунке 1 (Приложение 1).

2. Задержка роста при действии ампициллина составила: у Bacillus subtilis – 3.8 см, Bacillus mesentericus – 2.5 см, Bacillus cereus – 3.3 см. Результаты приведены на Рисунке 2 (Приложение 2).

3. В чашке Петри со стрептомицином задержка роста у Bacillus subtilis – 2.2 см, Bacillus mesentericus – 2 см, Bacillus cereus – 2.5 см.

При изучении влияния различных концентраций бензилпенициллина и стрептомицина на культуру Bacillus cereus (метод титров в плотных средах) получили следующие результаты:

1.В пробирках с различной концентрацией стрептомицина в питательной среде наблюдали неодинаковую интенсивность роста колоний. Отсутствием роста микроорганизмов характеризуется пробирка с добавлением антибиотика концентрацией 10000 ед./мл. Наибольшее развитие колоний наблюдали при концентрациях стрептомицина 10 ед./мл и 100 ед./мл (колонии ровные, распространены по всей поверхности питательной среды ). При концентрации антибиотика 1000 ед./мл, растворённой в 4 мл питательного агара, микроорганизмы развиваются отдельными скоплениями, колонии неровные, мелкие, распространены по питательной среде неравномерно.

2. Во всех пробирках с различной концентрацией бензилбенициллина в питательной среде наблюдали развитие колоний культуры Bacillus cereus. Интенсивность роста колоний увеличивается с уменьшением концентрации антибиотика. Наименьшее развитие и распространение микроорганизмов наблюдали в пробирке с концентрацией 10000 ед./мл, наибольшее – при концентрации 10 ед./мл, растворённой в 4 мл среды.

Выводы

1. Изучив чувствительность бактерий рода Bacillus к различным антибиотикам (пенициллин, ампициллин, стрептомицин), установили, что данные микроорганизмы наиболее чувствительны к ампициллину и стрептомицину, чувствительность к бензилпенициллину минимальна. Такую устойчивость к пенициллину можно объяснить возможностью некоторых представителей рода Bacillus (например, Bacillus subtilis и Bacillus cereus) образовывать фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин.

Что касается индивидуальной чувствительности, то наименее устойчивым к данным антибиотикам оказалась культура Bacillus subtilis. Bacillus mesentericus проявляет наибольшую устойчивость к стрептомицину и ампициллину, по сравнению с другими видами. К пенициллину самым устойчивым является Bacillus cereus.

2. В результате изучения влияния различных концентраций антибиотика, добавленного в питательную среду, на культуру Bacillus cereus, установили, что данный штамм устойчив даже к значительной концентрации бензилпенициллина (10000 ед./мл). Полученный результат доказывает возможность появления резистентности бактерий рода Bacillus к пенициллину, которая связана с образованием пенициллиназы.

Более чувствительным Bacillus cereus является по отношению к стрептомицину. Антибиотик концентрацией 10000 ед./мл, растворённый в 4 мл питательной среды полностью подавляет рост культуры, при концентрации 1000 ед./мл происходит угнетение роста, развитие минимальное.

Таким образом, стрептомицин оказывает большее влияние на бактерии рода Bacillus, чем пенициллин. Это объясняется широким спектром действия стрептомицина и тем, что многие чувствительные к пенициллину микроорганизмы относительно легко и быстро приобретают устойчивость к антибиотику.

Список литературы

1. Бриан Л. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам / Перевод с англ. А. Я. Ивлевой. – Москва: Медицина, 1984.- 270 с.

2. Воробьев А. А., Кривошеин Ю. С., Быков А. С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. Москва: Мастерство, 2001.- 224 с.

3. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология (третье издание). Москва: Издательство Московского университета, 1992.- с.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках (5-ое издание, переработанное и дополненное). Москва: Издательство Московского университета, 1994.- 512 с.

5. Ермольева З. В. Стрептомицин. Москва, Медгиз, 1956.- 59 с.

6. Гаузе Г. Ф. Лекции по антибиотикам (издание 2-ое, переработанное и дополненное). Москва, 1953.- 251 с.

7. Кашкин П. Н., Елинов Н. П. Антибиотики. Ленинград: Медицина, Ленинградское отделение, 1970.- 375 с.

8. Покровский В. Н. Антибиотики и бактерии. Москва: Знание, 1990. 64 с.

9. Сазыкин Ю. О. Биохимические основы действия антибиотиков на микробную клетку. Москва: Наука, 1965.- 267 с.

10. Шемякин Хохлов 1961

11. Дзержинская И. С. Методы выделения, исследования и определения антибиотической активности микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами: Методические указания к практическим работам по дисциплине Антибиотики для студентов специальности 012400 «Микробиология» / АГТУ.– Астрахань, 2005.- 76 с.

Приложение 1