В то же время проблематично существование особых факторов транскрипции для специфических функци в элементах промотора, особенно в таких системах, как G-бокс, поскольку существуют многочисленные синергические специфические для G-бокса факторы, в частности, промотора алкогольдегидрогеназы у Arabidopsis, которы регулирует экспрессию в ответ на холодовое возде ствие и обезвоживание.

12. Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией

В ходе исследований по изучению влияния низкотемпературно акклиматизации на экспрессию генов в растениях выявлено и охарактеризовано значительное число генов, экспрессия которых индуцируется во время этого процесса как в травянистых, так и в древесных растениях. Значительное число этих генов индуцируется также экзогенно абсцизово кислото и засухо. В то же время выявлены гены, которые специфичны для процесса акклиматизации растения к низким температурам и не индуцируются другими типами абиотического стресса.

Для установления молекулярных основ холодово акклиматизации у клубники было проведено выявление генов, ассоциированных с низкотемпературно акклиматизацие.

Дифференциальный скрининг библиотеки кДНК, изготовленно из акклиматизированных к холоду растений клубники, позволил изолировать различные кДНК, дифференциально экспрессирующиеся при низкотемпературно акклиматизации. Нозерн-блот анализ показал, что уровень транскриптов Fcor1 возрастал после 2 дне низкотемпературно акклиматизации, в то время как аналогичны показатель Fcor2 увеличивался только после 2 недель низкотемпературно акклиматизации. С друго стороны, уровень содержания транскриптов Fcor3 снижался в течение 24 часов воздействия низкотемпературно акклиматизации и оставался на низком уровне в течение 8 недель периода акклиматизации. Гены Fcor1 и Fcor2 экспрессируются во всех тканях, в то время как ген Fcor3 специфичен для листьев. Кодируемы геном Fcor1 белок имеет высокое содержание ле цина, изолейцина, глицина, пролина и серина. Данный белок имеет гомологию с белками, кодируемыми геном ячменя blt101, индуцируемым низкотемпературно акклиматизацие, и геном Lophopyrum esi3, индуцируемым солевым стрессом. Белок FCOR2 богат лизином, лейцином, валином, аланином и аргинином и не имеет гомологии ни с каким из продуктов известных генов. Частичны клон кДНК Fcor3 кодирует полипептид, имеющий очень высокую идентичность с субъединице V PSI из шпината и с полипептидом PSI Psag из ячменя. Уровень накопления транскриптов Fcor1 коррелирует с устойчивостью к замораживанию у исследованных сортов клубники.

Клон кДНК pbn59 был изолирован путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК акклиматизированного к холоду озимого рапса. Нуклеотидная последовательность BN59 оказалась гомологичной последовательности, кодирующей 70 кДа субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы в растениях. Транскрипты, гибридизующиеся с BN59, аккумулируются во время воздействия низко температуры и воздействия экзогенно абсцизовой кислоты. Вестерн-блоттинг белков также показал увеличение содержания 70 кДа субъединицы во время акклиматизации к холоду. Накопление эндомембранной Н+-АТФазы следует также из наблюдений за осмотическим регулированием, увеличением содержания эндогенно абсцизово кислоты и пролиферации эндомембран в течение холодной акклиматизации.

Двенадцать клонов индуцируемых холодом кДНК были изолированы путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК, подготовленной из мРНК холодоустойчивого картофеля. При помощи нозерн-блот гибридизации было проанализировано накопление мРНК, соответствующей каждому клону. Изолированные в данном исследовании клоны кДНК обозначены как Ssci. Все клоны отчетливо индуцировались в ответ на холод -накопление соответствующих транскриптов было замечено уже после одного дня закаливания к холоду. Максимальная аккумуляция мРНК, соответствующих клонам Ssci1, Ssci2, Ssci6 и Ssci8, была отмечена в первы день холодового закаливания, тогда как для клонов Ssci3, Ssci4, Ssci5, Ssci7, Ssci9, Ssci10, Ssci11 и Ssci12 - после 8 дне закаливания. Частичная последовательность ДНК была определена для 5' и 3' концов клонов и был произведен поиск гомологии с последовательностями в базах данных. Результаты поиска показали, что выделенные клоны кДНК соответствуют известным генам и кодируют мРНК для следующих белков: мРНК для двух различных S-аденозил-L-метионин декарбоксилаз, два хлоропластных шаперонина, белок цикла деления клетки CDC48, малатдегидрогеназу, мио-инозитол-1-фосфат синтетазу, протопорфирин IX:Mg хелатазу, фактор элонгации EF-1a, хлоропластный фактор элонгации трансляции EF-G, рибосомальный белок L-3 и мРНК для белка томата TAS14, индуцируемого экзогенно абсцизовой кислото. Выявленные гены могут участвовать в двух различных механизмах, относящихся к холодоустойчивости. Одна группа может предохранять хлоропласты и клеточные структуры во время стресса, в то время как другая может быть вовлечена в механизмы приспособления растительной клетки к холоду

Были изучены некоторые из ответов мутантов Arabidopsis thaliana L., не развивающих максимальной холодостойкости после холодовой акклиматизации, на холодовое воздействие. В ходе экспериментов были изучены холодовая индукция трех белков, уровни содержания сахарозы и глюкозы, жирнокислотный состав липидов, а также накопление антоцианинов в листьях. Четыре мутации понижали или устраняли накопление антоцианина во время холодно акклиматизации. Одна мутация предотвращала индуцируемое холодом в норме повышение уровня содержания сахарозы и глюкозы. Мутации sfr4 и sfr7 влияли на жирнокислотный состав липидов после холодовой акклиматизации. С другой стороны, поскольку все исследованные параметры у мутаций sfr1, sfr2 и sfr5 не отличались от таковых у дикого типа, то предполагается, что они имеют другое, вполне возможно, высокоспецифическое действие в ответ на низкотемпературное воздействие.

Регулируемый холодом оперон rbpA1-rpsU кодирует РНК-связывающий белок и рибосомальный белок M3 у Anabaena variabilis. Уровень экспрессии этой группы генов примерно в десять раз выше при температурах ниже 30 0C, чем при 38 0C. С целью изучения функций белка RbpA1 in vivo был создан нарушенный вставкой ген rbpA1. Эти мутанты были полностью лишены белка RbpA1, но содержали нормальны уровень продукта гена rpsU - рибосомального белка S21. При 38 0C мутанты были морфологически нормальными, но при 22 0C они с небольшой частотой производили необычные клетки. По-видимому, эти клетки были на начальном этапе образования прогетероцист. В присутствии нитрата при 22 0C у мутантов на молекулярном уровне также происходили различные события, обуславливающиеся инициацией превращения в гетероцисты, а именно, иссечение 11-kbp элемента ДНК в nifD и накоплении копи xisA и hetR, но в то же время эти события не происходили в присутствии аммония или при 38 0C. Полученные результаты позволяют считать, что RbpA1 необходим для полно репрессии инициации образования гетероцист при низких температурах в присутствии нитрата.

В ходе изучения низкотемпературного ответа генома Arabidopsis thaliana были охарактеризованы две связанные кДНК, соответствующие генам, экспрессия которых временно индуцируется низкими температурами. RCI2A и RCI2B кодируют небольшие сильно гидрофобные белки, которые несут два потенциальных трансмембранных домена. Анализ их аминокислотно последовательности показал сродство с регулируемыми различными стрессовыми условиями белками, кодируемыми генами из ячменя и Lophophyrom elongatum. Их высоки уровень гомологии последовательностей и их геномная локализация в отдельном рестрикционном фрагменте подтверждают то, что оба гена появились в результате тандемной дупликации. В то же время их регулирующие последовательности достаточно различаются для того, чтобы считать их различными генами. Подобно большинству охарактеризованных индуцируемых холодом генов растений, экспрессия RCI2A и RCI2B также усиливается экзогенно абсцизовой кислотой и дегидратацией, но не обще реакцией растения на стрессовые условия, поскольку она не индуцируется солевым стрессом или анаэробиозом. Более того, низкая температура способна вызвать экспрессию RCI2A и RCI2B в ABA-дефицитной и нечувствительной генетической среде, что свидетельствует о том, что низкотемпературны ответ этих двух генов регулирует и зависимые от абсцизово кислоты, и независимые от нее пути.