Почему же детергенты разрушают мембрану? Да потому, что молекулы, образующие мицеллы, и молекулы, склонные к формированию мембран, предъявляют разные требования к геометрии образуемых ими ассоциатов (рис. 2).

Молекулы детергентов, обладающие довольно объемной гидрофильной областью и относительно небольшим гидрофобным участком, в целом имеют форму конуса и поэтому легко упаковываются в структуры с высокой кривизной поверхности типа сферических или цилиндрических мицелл. В свою очередь, в липидных молекулах, образующих мембраны, различия в размерах гидрофильной и гидрофобной области не столь велики. В силу этого они имеют форму цилиндра (или бруска) и лучше всего упаковываются в протяженные липидные бислои минимальной кривизны. Поэтому при одновременном присутствии детергента и липида в составе одного агрегата возникает конфликт между стремлением детергента принять мицеллярную конфигурацию и тенденцией липида сохранить бислойную упаковку молекул в мембране.

Пока детергента в мембране мало, его присутствие проявляется лишь в возникновении дефектов упаковки молекул в липидном бислое с образованием пор, проницаемых для водорастворимых соединений. Но по мере роста содержания детергента изменения упаковки становятся все более значительными и в конечном счете вызывают нарушения целостности мембраны, что приводит к ее разрывам и даже к фрагментации на отдельные частицы. Однако эти частицы все еще сохраняют мембранную организацию, и вся система в целом по-прежнему может рассматриваться как раствор детергента в мембране.

Когда же концентрация детергента в мембране достигает некоторой критической величины и дальнейшее сохранение бислойной организации молекул становится энергетически невыгодным, мембрана начинает разрушаться с образованием смешанных липид-детергентных и белок-детергентных мицелл, которые фактически представляют собой раствор компонентов мембраны в избытке детергента (рис. 3). Это и есть момент солюбилизации, которая приводит к резкому уменьшению размера частиц и как следствие этого – к снижению мутности мембранной суспензии и уменьшению количества материала, осаждаемого при центрифугировании.

Для солюбилизации лучше использовать детергенты с низкой ККМ, так как такие детергенты легче встраиваются в мембрану и быстрее вызывают ее распад до смешанных мицелл. В этом качестве наиболее эффективны ионные детергенты, но их недостатком является то, что нередко они вызывают денатурацию белков. Особенно часто это происходит в случае катионных детергентов. Иногда денатурацию можно предотвратить добавив липид в белковый солюбилизат. Неионные детергенты менее эффективны в качестве солюбилизирующих агентов и иногда не полностью отделяют липиды от белков. Но, возможно, именно поэтому в присутствии неионных детергентов белки лучше сохраняют свою активность.

В солюбилизированном состоянии мембранные белки можно легко отделить от основной массы липидов и подвергнуть дальнейшему фракционированию с целью выделения индивидуального белка или группы белков с интересующим исследователя типом активности. Методы такого фракционирования в настоящее время хорошо отработаны и включают специальные приемы разделения белков с помощью гель-фильтрации, хроматографии и электрофореза в водном буфере, содержащем детергент в концентрации, равной или превышающей его ККМ. В некоторых случаях солюбилизированные препараты выделенных мембранных белков можно использовать для проведения структурно-функциональных исследований, но чаще всего для этого необходимы реконструированные препараты, так как многие мембранные белки могут проявить свою функциональную активность только тогда, когда они находятся в полноценном мембранном окружении.

Почему и как мембрана собирается

Собственно говоря, сборка мембран происходит в соответствии с теми же принципами, что и их разборка. Если содержание детергента в смешанных мицеллах уменьшать, то стремление солюбилизированных в них молекул к мембранному типу упаковки заставит мицеллы сливаться друг с другом и в какой-то момент, когда оставшегося детергента станет уже недостаточно для сохранения высокой кривизны поверхности в укрупнившихся мицеллярных агрегатах, они превращаются в мембранные структуры.

Таким образом, процессы солюбилизации и реконструкции мембраны зеркально симметричны в смысле обратимости превращений, происходящих при изменении содержания детергента в смеси. Более того, они протекают самопроизвольно, если концентрация детергента становится выше или ниже определенного предела. Единственное, что требуется, чтобы запустить процесс реконструкции, – это знать, каким образом можно удалить детергент из имеющегося солюбилизата.

В принципе с этим тоже нет больших проблем, поскольку сейчас имеется широкий набор различных способов удаления детергентов. Выбор подходящего способа определяется задачами реконструкции, а также типом детергента, который необходимо удалить. Чаще всего используются четыре основных способа удаления детергента: диализ, гель-фильтрация, сильное разбавление солюбилизата и адсорбция детергента на гидрофобных полимерах.

Самый простой способ – это удаление детергента с помощью диализа через полупроницаемую целлофановую мембрану. Поскольку молекулы детергента достаточно малы, чтобы пройти через поры диализной мембраны, а концентрация его мономеров в воде, зависящая от ККМ, сравнительно высока, то детергент постепенно переходит из солюбилизата в диализующий раствор. При этом его содержание в смешанных мицеллах уменьшается и, когда оно становится достаточно низким, мицеллы трансформируются в мембранные структуры. Этот способ хорош для детергентов с высокой ККМ, таких, например, как октилглюкозид или холат натрия. Но неионные детергенты с низкой ККМ типа тритона Х-100 при диализе удаляются не полностью. Другой недостаток этого метода состоит в его длительности, так как даже в лучшем случае удаление детергента может занять несколько суток.

Более быстрый способ основан на удалении детергента с помощью гель-фильтрации, когда солюбилизат пропускают через инертный гель, размер пор которого достаточно велик, чтобы удержать молекулы детергента, но мал по сравнению с образующимися мембранными частицами, которые свободно проходят между гранулами геля. Несмотря на быстроту, этот метод не всегда удобен в работе, особенно когда требуется провести реконструкцию большого количества образцов.

Еще быстрее, а фактически почти мгновенно реконструкцию можно осуществить методом быстрого разбавления. Для этого солюбилизат разводят большим объемом не содержащей детергента среды, в результате чего содержание детергента в мицеллах резко падает ниже предельного уровня, которым определяется момент начала формирования мембраны. Этот метод универсален и годится для удаления практически любого детергента. Проблема лишь в том, что сам образец при этом сильно разбавляется, да и детергент удаляется из мембраны далеко не полностью, что может отрицательно сказаться на качестве реконструированного мембранного препарата.