Другие методы фенотипического скрининга в эукариотических клетках. Фенотипический скрининг редко применяется при работе с диплоидными эукариотическими клетками, поскольку для этого необходима линия клеток, у которых повреждены оба аллеля интересующего нас гена. Идентифицировать трансформированные клетки можно с помощью котрансформации, применяя селективный маркер и соответствующие мутантные клетки или доминантный маркер и клетки, ингибируемые антибиотиком. Однако при этом невозможно различить нужный котрансформант и сопутствующие контрансформированные колонии, содержащие разные рекомбинантные молекулы ДНК. Поэтому обычно скрининг основывается на использовании специфических свойств, проявляемых нужным клоном. В качестве примера можно привести морфологические изменения, наблюдаемые при превращении нормальных клеток в опухолевые, который описан в разделах, посвященных векторам на основе папилломавирусов крупного рогатого скота и ретровирусов. Клетки, трансформированные к онкогенному фенотипу, образуют характерную колонию, или фокус, в отличие от обычных клеток, образующих монослой. Этот метод использовали, например, при отборе рекомбинантов, содержащих клеточные онкогены из геномной ДНК животных.

Другой метод скрининга применяют при клонировании клеток животных, в которых экспрессируется рекомбинантный ген, кодирующий секретируемый полипептид. При этом используют клетки хозяина, в норме не образующие полипептид, и тестируют среду, в которой находятся трансформированные клетки, на присутствие в ней данного полипептида. Если продуктом является гормон, то его присутствие в среде можно обнаружить с помощью какого-либо удобного высокочувствительного биологического метода. Таким же способом были клонированы гены, кодирующие факторы роста, которые стимулируют пролиферацию специфических клеток-мишеней. Если активность полипептида как такового трудно измерить, то используют специфичные к нему антитела. Этот метод непригоден для одновременного скрининга большой популяции клонированных клеток, содержащих разные рекомбинантные молекулы, поскольку для этого пришлось бы проводить слишком много отдельных тестов. Вместо этого смесь трансформированных клеток подразделяют на удобное число отдельных групп и тестируют эти группы. Группу, дающую положительный ответ, снова подразделяют на подгруппы, вновь выделяют позитивную подгруппу, подразделяют ее, тестируют и так далее до тех пор, пока не будет идентифицирован один позитивный клон.

Иммунологический скрининг. Для скрининга рекомбинантной популяции в отношении экспрессии данного гена используют более общий метод, в основе которого лежит иммунологический подход. Синтезируемый белок в этом случае не должен быть функционально активным; необходимы лишь специфические антитела к нему и клетки хозяина, не синтезирующие данный антиген. Антитела взаимодействуют с белковыми молекулами одного клона. Их выявляют по аккумуляции радиоактивности, источником которой служат либо меченые антитела, либо специфические меченые реагенты, узнающие иммуноглобулины.

Было разработано несколько модификаций техники скрининга с участием антител применительно к Е. сой-системам хозяин-вектор. Все они сходны между собой, хотя применяемые приемы зависят, например, от того, какого рода клоны - бактериальные или фаговые-будут тестироваться. В одной из модификаций этого метода антитела равномерно распределяют по поверхности твердого носителя, например пластикового или бумажного диска, и затем прижимают его к агаровому слою, содержащему лизированные колонии или фаговые бляшки. Если специфический антиген синтезируется каким-либо клоном, он будет связываться с антителом на диске. Антиген можно локализовать, обработав снятый с агара диск другими радиоактивно меченными антителами, промыв диск и получив радиоавтограф. Эта процедура зависит от способности двух антител связываться с разными антигенными детерминантами на одном и том же полипептиде. Как и при скрининге путем отжига с ДНК - или РНК-зондами, позитивный клон дает четкое темное пятно на рентгеновской пленке.

Если интересующий нас ген кодирует полипептид, расположенный на поверхности животной клетки, то с помощью высокоспецифических методов можно провести иммунологический скрининг и отбор трансформированных клеток. Поверхностные белки могут взаимодействовать со специфическими антителами, а если эти антитела связываются с какой-либо флуоресцентной меткой, то клетки, синтезирующие данный белок, будут отличаться от других трансформантов по своим флуоресцентным свойствам. Жизнеспособные флуоресцирующие клетки выявляют среди громадного числа нефлуоресцирующих клеток с помощью специального прибора. Далее жизнеспособные клетки размножают и получают популяцию клонированных клеток. Некоторые поверхностные белки являются рецепторами, с которыми связываются специфические лиганды. Если исследуемый ген кодирует такой рецептор, то, используя флуоресцирующий лиганд, можно отделить трансформированные клетки с помощью прибора FACS.

Библиотеки

Возможность проведения шотган-экспериментов рассматривалась еще тогда, когда технология рекомбинантных ДНК делала свои первые шаги. Идея амплификации очень сложных смесей фрагментов ДНК и последующего обнаружения одного из них казалась фантастичной, а сейчас она представляется почти банальной. Основной принцип этого подхода состоит в создании коллекции рекомбинантных молекул, составляющих полный геном данного организма. По существу, полный нефракционированный набор фрагментов ДНК превращают в соответствующий набор стабильных рекомбинантов, который можно сохранять и многократно использовать для клонирования различных вставок. При этом применяются Е. сой-системы хозяин-вектор, где в качестве вектора используются плазмиды или бактериофаги, поскольку они более пригодны для получения большого числа рекомбинантных молекул и удобны для хранения.

Наиболее важны два типа библиотек. Одна из них, создаваемая из суммарной геномной ДНК, в принципе должна содержать все гены данного организма. Однако такая цель обычно оказывается недостижимой, поскольку некоторые последовательности ДНК не удается клонировать. Один из вариантов геномной библиотеки представляет собой всю ДНК какой-то одной хромосомы. Для создания такой библиотеки необходимо выделить ДНК из отдельных хромосом. Хромосомы человека фракционируют с помощью методов, аналогичных используемым при сортировке флуоресцирующих и нефлуоресцирующих клеток. Метод основан на разной эффективности связывания флуоресцирующих красителей с хромосомами, которая зависит от размера хромосом и GC-содержания ДНК. Раствор окрашенных хромосом пропускают с высокой скоростью через узкое отверстие, на которое сфокусирован пучок света, испускаемого лазером. Хромосомы поочередно пересекают этот пучок, который индуцирует их специфическую флуоресценцию. Детектор определяет интенсивность флуоресценции и изменяет направление движения тех хромосом, интенсивность флуоресценции которых превышает заданную величину, таким образом, что они попадают в специальный коллектор. Изменяя этот заранее установленный уровень интенсивности флуоресценции, можно отбирать разные хромосомы.