Образование при расщеплении рестриктазами фрагментов с «липкими» концами:

5 G ↓ AATTC 3 5 C ↓ CGG 3

EcoR Ī 3 CTTAA ↑ G 5 Hpa ĪĪ 3 GGC ↑ C 5

Образование при расщеплении рестриктазами фрагментов с «тупыми» концами:

TA ↓ GA 3 5 GTT ↓ AAC 3

Taq Ī 3 AT ↑ CT 5 Hinc Ī 3 CAA ↑ TTG 5

Фрагменты ДНК,имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, так как ДНК-лигаза обеспечивает беспрепятственное соединение фрагментов.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных условиях. оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от рН, ионной силы, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции. Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии.

Вопрос № 2. Методы получения химер

Успешна пересадка эмбрионов может быть осуществленатолько между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овцам и козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии

Сначала были получены химерные животные путем объединения бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный объединенный эмбрион состоял из равного числа бластомеров эмбрионов от 2 – 8 родителей. При этом общее число клеток колебалось от четырех- до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яйцеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получили живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Получены химерные овцы путем инъекции внутренней клеточной массы, выделенной иммунохирургическим путем из эмбрионов доноров в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бластоцист доноров удаляли инкубированием в 0,5%-ной проназе и пептированием.

Для восстановления их функции после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрачной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыворотке к клеткам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофобласта удаляли пипетированием, а изолированную внутреннюю клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента. После пересадки этих бластоцист получены химерные ягнята как по рпизнакам групп крови, так и повнешним признакам.

Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 5 – 6,5-дневных эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пересадки агрегированных эмбрионов, не имели признаков химеризма. Один теленок был химерой двух пород – бурой швицкой и голштинофризской. Однако масть бурой швицкой породы доминировала. Анализ крови этого теленка показал присутствие групп крови только от родителей голштинофризской породы. Другой теленок был химерой неопределенного происхождения.

Показана высокая эффективность получения химер крупного рогатого скота объединением морул без зоны пеллюциды. Авторы получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой». В этих исследованиях показано, что передача химерам родительского типа имеет случайный характер, т.е. потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерес.

Наиболее показательно получение химер от объединенных частей эмбрионов разных видов, например, овцы и козы.

Исследования С.В. Фехилли и др. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4 – 5 сут в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью.

химеры фермент нуклеаз

Вопрос № 3. Выписать и дать объяснения терминам встретившимся при написании контрольной работы

Бактериофаги (фаги) – вирусы, инфицирующие бактерии.

Библиотека генома – набор клонированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном.

Брешь (пробел) в ДНК – отсутствие одного или нескольких нуклеотидов в цепи ДНК.

Гаплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся одинарным набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного данному виду организмов (символ n).

Ген– единичная структура генетической информации, участок хромосомы (молекулы ДНК), кодирующий структуру одной или нескольких полипептидных цепей, или молекул РНК, или определенную регуляторную функцию.

Генная инженерия – совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с ними и введению их в другие организмы.

Диплоид - ядро, клетка, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленных числом, характерным для данного вида (символ 2n).

ДНК – молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов (аденин, гуанин, цитозин, тимин), дезоксирибозы и остатков фосфорной кислоты.

Комплементарная цепь – одна из цепей ДНК, используемая в качестве матрицы для синтеза РНК и соответствующая ей по взаимодействию пар нуклеотидов.

Лигирование – образование фосфодиэфирной связи между двумя основаниями одной цепи ДНК, разделенным разрывом. Этот термин употребляют также в случае соединения тупых концов и при образовании связи в РНК.

Липкий конец – свободный одноцепочечный конец двуцепочечной ДНК,комплементарной одноцепочечному концу, принадлежащему этой же или другой молекуле ДНК.

Промотор – участок гена, ответственный за начало его транскрипции.

РНК – молекула рибонуклеиновой кислоты, в состав которой входят нуклеотиды (аденин, гуанин, цитозин, урацил), рибоза и остатки фосфорной кислоты.