При пищевых отравлениях исследуют остатки пищевых продуктов, рвотные массы, промывные воды и испражнения больных, преследуя две цели: выделение стафилококков и обнаружение энтеротоксина.

Для выявления патогенных стафилококков делают посевы в жидкую накопительную среду, содержащую 10–15% хлористого натрия. После 24–48-часового термостатирования проводят посев на МПА и идентифицируют патогенные стафилококки Дифференциацию патогенных и сапрофитных стафилококков проводят по способности вызывать коагуляцию плазмы и по чувствительности к бактериофагам.

В настоящее время выделено около 40 различных фаготипов стафилококков. Фаготипизирование имеет большое значение для дифференциации стафилококков и определения источников загрязнения продуктов. При дифференциации патогенных и сапрофитных стафилококков учитывают также пигментообразование, ферментацию маннита и гемолитические свойства. В качестве элективно-дифференциальных сред используют молрчно-солевой и кровяно-солевой агар. Чистую культуру стафилококков из фекалий, рвотных масс получают на среде Чепмена, которая содержит 7% хлористого натрия, кристалл-виолет, лактозу или на желточно-солевом агаре (ЖСА) с 10% поваренной соли в 10–20% желточной взвеси. Большая концентрация хлористого натрия подавляет развитие посторонней микрофлоры, но не препятствует росту стафилококков.

Наличие энтеротоксина в исследуемом материале устанавливают по реакции преципитации в агаре с моно-специфическими антиэнтеротоксическими сыворотками, а также по результатам биологической пробы. В лабораториях биологическую пробу ставят на котятах или щенках. Лабораторные животные погибают через 15–20 мин после внутривенного или внутрибрюшинного введения фильтрата бульонных культур или экстрактов из материала. У животных после скармливания остатков пищевых продуктов через 3–6 ч возникает рвота, диарея.

5. Выявление и определение количества стафилококков в пищевых продуктах

Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 10444.2–94. Для этого делают посев в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на агаризованные селективно-диагностические среды. Посев делают в жидкие среды, если в навеске менее 150 (15) колониеобразующих единиц (КОЕ), и на плотные среды, если в навеске (объеме) более 150 (15) КОЕ.

При содержании в 1 г твердого продукта менее 1 500 КОЕ (или в 1 см3 жидкого продукта менее 150 КОЕ) определяют наиболее вероятное число (НВЧ) посевом в жидкую селективную среду. При подозрении на наличие в 1 г (1 см3) жидкого продукта более 1500 (150) КОЕ этого вида микроорганизмов посев проводят на плотные селективно-диагностические среды.

Методы выявления и определения НВЧ S.aureus с предварительным обогащением предусматривают высев навески продукта и (или) ее разведений в жидкую селективную среду, инкубирование посевов, пересев на агаризованные селективно-диагностические среды, подтверждение по биохимическим признакам принадлежности выделенных культур к S.aureus.

Выявление и определение количества S.aureus с использованием агаризованных селективно-диагностических сред включают следующие стадии: высев навески или разведения навески продукта; инкубирование посевов; подсчет колоний с характерными для S.aureus признаками; идентификацию выделенных культур.

Из навески продукта готовят исходное и ряд 10-кратных разведений так, чтобы можно было определить в 1 г (см3) продукта предполагаемое или указанное в нормативно-технической документации количество S.aureus Степень разведения навески для посева на плотные среды выбирают такой, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке Петри, было в пределах 15–300, а в жидких средах, чтобы хотя бы в одной пробирке с наибольшим разведением отсутствовали микроорганизмы.

При определении количества S.aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см3 продукта (или его разведения) наносят на поверхность агара Байрда–Паркера, молочно-солевого, яично-желточно-азидного или яично-желточно-солевого агара в двух чашках.

При определении количества S.aureus по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбу или пробирки с одной из сред. Соотношение между количеством высеваемого продукта (или его разведения) и питательной средой 1:6 или 1:7.

Самое низкое разведение и высеваемые объемы выбирают в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов и чувствительности метода следующим образом:

по 1 см3 из разведения 10-1 и более высокого, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1 г (1 см3) продукта;

по 10 см3 из разведения 10-1 или 1 см3 неразведенного продукта и по 1 см3 из разведения 10-1 и более высокого, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10 г. (10 см3) продукта;

по 10 и 1 см3 неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 100 см3 продукта.

Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с 10 см3 питательной среды. В среду нормальной концентрации высевают 1 см3, двойной концентрации – 10 см3.

При выявлении S.aureus в определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) с предварительным обогащением эту навеску (разведение) вносят в одну из питательных сред в соотношении 1:6 или 1:7.

При анализе пищевых продуктов с высоким содержанием NaС1 проводят посев продукта (или его исходного разведения) в сахарный бульон. Во всех других случаях для посева используют солевой бульон.

При выявлении S.aureus в определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) без предварительного обогащения эту навеску (разведение) в количестве 0,1 г (или 0,2 см3) наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют в термостате при 36 ± 1°С в течение 48 ч, чашки Петри ставят дном вверх.

Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них делают пересевы петлей на поверхность одной из селективно-диагностических сред, помещают в термостат при 36±1°С на 24–48 ч и затем проводят учет.

Характерные признаки роста S.aureus на плотных средах приведены ниже.

Агар Байрда–Паркера Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5 – 2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности

Агар молочно-солевой Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности

Агар яично-желточно – азидный и яично-желточно-солевой

Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности

Колонии круглые, диаметром 2–2,5 мм, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными края ми, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет

Для подсчета количества S.aureus отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Для подтверждения наличия в продукте стафилококка отбирают не менее 5 характерных колоний и пересевают на скошенный мясопептонный агар. Через 24 ч после термостатирования при 36+1°С определяют морфологию в мазках, окрашенных по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.