Успех микроскопического исследования во многом зависит от качества приготовленных препаратов, возможностей и технического состояния светового микроскопа и опыта бактериолога. Для работы необходимо использовать микроскопы с высоким разрешением (0,14 – 0,2 мкм) и общим увеличением в 1350 – 2000 раз.

Люминесцентная микроскопия. Для индикации хламидий в исследуемом материале используют метод флуорохромирования. Техника окраски: препараты (мазки) фиксируют жидкостью Корнуа в течение 5 мин; двукратно отмыва­ют фосфатно-цитратным буфером по 2 — 4 мин; наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10 — 20 мин; трижды отмывают фосфатно-цитратным буфе­ром по 2 мин и больше; заключают в этот буфер, при­крепляя покровное стекло парафином.

Исследуют в люминесцентном микроскопе (лучше в падающем свете) с комбинацией фильтров СЗС, БС, ФС.

Элементарные тельца хламидий флуоресцируют яр­ко-зеленым светом, их промежуточные формы — от соло­менно-темного до оранжевого свечения. Подобные структуры обнаруживают, как внутри, так и вне клеток.

Метод дает хорошие результаты при исследовании мазков из патологического материала, особенно плодовых оболочек абортировавших животных (см. приложение 2).

Идентификация хламидий проводится с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Используют прямой и непрямой варианты.

Для приготовления препаратов используют стекла с матовой площадкой у края и надписи ведут простым карандашом.

Прямой метод иммунофлуоресценции. Фиксированные холодным ацетоном препараты после промывания ФСБР обрабатывают синькой Эванса 30-40 с, промывают водопроводной водой.

При отсутствии синьки Эванса препараты обрабаты­вают смесью в равных объемах, состоящей из флуорес­цирующей хламидийной сыворотки (содержит антитела против хламидий, меченые ФИТЦ) и бычьего альбуми­на, меченного родамином, взятого в удвоенном титре.

В случае применения синьки Эванса препараты обра­батывают только меченой флуоресцирующей хламидий­ной сывороткой (в термостате при +37°С в течение 30-40 мин во влажной камере). Тщательно промывают ФСБР, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стек­лом, исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой вариант реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Готовят следующие растворы: фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) —6,8 г NаС1, 0,63 г КН2РО4 и 1,48 г Nа2НРО4 последовательно растворяют в 1 л ди­стиллированной воды рН 7,2; забуференный глицерин - смешивают одну часть ФСБР с девятью частями глице­рина; раствор синьки Эванса: 1 г синьки растворяют в 100 мл дистиллированной воды во флаконе из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора красителя (1: 10000) берут 0,1 мл раствора 1: 100 и объем дово­дят дистиллированной водой до 10 мл.

Техника окраски: мазки из патологического материа­ла, инфицированных клеточных культур и т. п. фиксиру­ют ацетоном на холоде в течение 5—10 мин, промывают ФСБР и подсушивают на воздухе. Для устранения не­специфической люминесценции фона на мазки на 30- 40 с наносят рабочий раствор синьки Эванса (1 : 10000), которую смывают слабой струей водопроводной воды. Наносят на каждый препарат 1-2 капли кроличьей (или другого вида животного) иммунной антихламидийной сыворотки, содержащей обычные немеченные анти­тела против хламидий в титре не ниже 1:32-1:64. Препарат помещают во влажную камеру и помещают в термостат при температуре - 37°С на 30-40 мин.

Затем тщательно промывают ФСБР три раза по 5—10 мин; на препараты наносят антивидовую (содержащую мече­ные ФИТЦ антитела против глобулинов того вида жи­вотного, с использованием которого получена первая им­мунная сыворотка) сыворотку, выдерживают в термостате при температуре +37°С во влажной камере 30-40 минут. Тщательно промывают ФСБР. На каждый препарат наносят по капле забуференного глицерина, на­крывают покровным стеклом, которое прикрепляют рас­плавленным парафином. Препараты исследуют под люминесцент­ным микроскопом в падающем свете при комбинации светофильтров ФС 1-2, БС-8-2, СЗС 7-2 и запирающем ЖС 18, объектив иммерсионный.

Препараты, обработанные синькой Эванса, в ультра­фиолетовых или сине-фиолетовых лучах, имеют красный фон разных оттенков, тогда как элементарные тельца хламидий, их колонии (включения) флуоресцируют зе­леным изумрудным светом.

При отсутствии синьки Эванса можно использовать для контрастирования фона бычий альбумин, меченный родамином, который в удвоенном титре смешивают с первой сывороткой 1:1.

Бычий альбумин уступает синьке Эванса в том смыс­ле, что каждый раз дополнительно необходимо опреде­лять его рабочую дозу методом титрации.

Фон препаратов, обработанных меченым бычьим аль­бумином, оранжевый, хламидийные структуры — изум­рудно-зеленые.

Контроли: первый тест блокировки — после обработ­ки препарата обычной иммунной (немеченой) хламидий­ной антисывороткой, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна вызвать свечения хламидиозного антигена (элементарных телец, промежуточных форм хламидий или их включений);

второй тест нейтрализации — после инкубации со спе­цифическим (хламидийным) антигеном, флуоресцирую­щая хламидийная сыворотка не должна давать замет­ного окрашивания хламидийного антигена;

третий — нормальная, не иммунная меченная ФИТЦ сыворотка того же вида животного, продуцента иммун­ной хламидийной антисыворотки, не должна окрашивать хламидийный антиген;

четвертый — в контрольных препаратах, приготовлен­ных из тканей заведомо здоровых животных, флуоресци­рующая хламидийная антисыворотка не должна окра­шивать цитоплазму клеток.

Метод выделения и культивирования хламидий.

Выделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала.

Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл, стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл.

Пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов.