Необходимо отметить, что многие из протеолитических ферментов микробного происхождения получены в кристаллическом виде, например, субтилизин КФ 3.4.21.14, сериновая эндопептидаза Alternaria КФ 3.4.21.16, сериновая протеиназа Arthrobacter КФ 3.4.21.14, кислая протеиназа Aspergillus oryzae КФ 3.4.23.6, кислая протеиназа Penicillium janthinellum КФ 3.4.26.6. и другие. Часто под одним номером находится очень много ферментов, получаемых из различных источников, но имеющих сходные свойства.

В промышленности чаще всего получают комплекс протеолитических ферментов, достоинства которого определяются с учётом аспектов последующего применения ферментного препарата. Общая протеолитическая активность препаратов определяется на стандартных субстратах (казеине, гемоглобине, казеинате натрия) в соответствии с известными методами и используется для сравнения эффективности их действия на специфические субстраты (коллаген, эластин, кератин, желатин и т.д.).

Следует отметить, что у нас в стране проведены определённые исследования и обобщения по эффективности микробных протеиназ при расщеплении белков животных тканей. Однако лишь для немногих из них глубоко изучены физико-химические свойства, проведена идентификация функциональных групп каталитического центра, исследованы кинетика гидролиза субстратов и субстратная специфичность, расшифрована первичная структура.

Производство протеолитических препаратов организовано на основе микроскопических грибов родов Aspergillus и Rhizopus при поверхностном культивировании продуцентов, а также на основе бактерий Bacillus (subtilis, mesentericus, licheniformis, cereus и др.) при глубинном культивировании.

Протеиназы, полученные из этих культур, обладают высокой активностью. Они находят широкое применение в различных отраслях промышленности для гидролиза животных и растительных белков. Среди микроорганизмов – продуцентов протеиназ не менее важное место, чем бактерии, занимают актиномицеты Streptomyces (bradia, griseus, fradiospiralis). Впервые способность синтезировать протеиназы актиномицетами была показана Ваксманом, а затем Красильниковым. С тех пор большое число работ советских и зарубежных учёных посвящено изучению протеолитических ферментов актиномицетов [6, 17]. В настоящее время появились работы, где описано использование актиномицетов в качестве продуцентов кератиназы [24], эластазы [28], коллагеназы [26]. Однако промышленный выпуск протеиназ из актиномицетов развит слабо. Известны лишь препараты протеиназ Streptomyces griseus и Streptomyces fradie.

Однако проведение глубоких исследований ферментов у микроорганизмов осложняется высокой гетерогенностью синтезируемых протеолитических комплексов, требующих особо тонких и чувствительных методов выделения и очистки. Комплексные препараты, получаемые на практике, дают специфические эффекты при гидролизе субстратов. Так, например, протеолитические ферменты бактериального и грибного происхождения действуют в основном на белки мышечной ткани. Вместе с тем, известны комплексные препараты, проявляющие активность в отношении коллагена и эластина. При исследовании различных субтилизинов установлена их высокая каталитическая активность и невысокая специфичность гидролитического действия, что допускает их использование в различных пищевых технологиях.

Протеиназа из Actinomyces fradiae,отнесённая к типу трипсиноподобных, способна также гидролизовать казеин, денатурированный коллаген, но не активна в отношении эластина.

Из культуральной жидкости Bacillus mesentericum 316М выделяют комплексный ферментный препарат, обладающий высокой протеолитической активностью к фибриллярным белкам, в том числе коллагену и эластину.

Из отходов производства антибиотиков получен протеолитический препарат (источник Streptomyces griseus). Он обладает высокой казеинолитической активностью, подвергая при этом гидролизу гемоглобин, эластин, коллаген и желатин.

Получение высокоочищенных фракций ферментов – длительный, сложный и дорогой процесс, а применение комплексных препаратов не всегда даёт желаемый эффект и требует исследования условий гидролиза не только на чистых субстратах, но и при обработке сложных белковых систем. При этом интерес представляет как глубина протеолиза, так и качественная характеристика продуктов реакции, поскольку именно они определяют не только функциональные, биологические и технологические свойства продуктов, но и могут проявлять физиологические эффекты в составе пищи.

1.2 Ферменты, их физико-химические свойства.

Протеиназы, включающие ферменты микробного происхождения, составляют около половины производства препаратов на мировом рынке. Их эффективность и мощность намного превосходят синтетические катализаторы. Они высокоспецифичны по отношению к своим субстратам и ускоряют строго определённые химические реакции без образования побочных продуктов; ферменты функционируют в разбавленных водных растворах при физиологических значениях рН и температуры.

Ферменты – функциональные единицы клеточного метаболизма. Действуя в строго определённой последовательности, они катализируют сотни многостадийных реакций, в ходе которых расщепляются молекулы питательных веществ, запасается и преобразуется химическая энергия, и из простых молекул-предшественников строятся макромолекулы, входящие в состав клетки.

Ферментативный катализ происходит на расстоянии длины химической связи, поэтому акт катализа совершается на определённом участке поверхности макромолекулы, называемом активным центром. Современный уровень экспериментальных исследований позволил доказать, что он представляет собой набор небольшого числа функциональных групп, расположенных близко друг от друга и имеет вид впадин, выемок на поверхности молекулы фермента. Функциональные группы активного центра могут принадлежать звеньям полипептидной цепи, весьма удалённым друг от друга. Сближение их связано с формированием третичной структуры молекулы фермента.

Вполне логично, что активный центр не имеет автономного существования. Нельзя провести какую-либо грань между активным центром фермента и остальной частью белковой молекулы. Именно это и является одной из причин высокой чувствительности и лабильности активного центра к различным воздействиям.

К наиболее важным характеристикам ферментных препаратов, которые определяют возможность их применения на практике, относят рН, температурный оптимум, субстратную специфичность. Кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН.

В 1964 году была получена в высокоочищенном состоянии нейтральная протеиназа Bacillus subtilis. Фермент имеет довольно широкий оптимум рН 6,5 – 8,0. В щелочной области рН её активность снижается, достигая при рН 9,0 – 30% максимальной величины. Таким образом, ферменты активны только в определённом интервале рН. В большинстве случаев для каждого фермента имеется определённый оптимум рН. Это объясняется несколькими причинами:

- истинное, обратимое влияние рН на скорость реакции (когда фермент насыщен субстратом);