2.4.1 Подготовка лекарственного растительного материала для

экстракции

На основании анализа литературных источников было установлено, что максимальное содержание биологически активных соединений находится в плодах расторопши пятнистой, причем более 95% этих соединений содержится в лузге.

Кроме того, выбор лузги семян расторопши пятнистой с зернением 0,1-0,3 мм обусловлен тем, что при этом обеспечивается хорошая проницаемость подвижной фазы в экстракторе, заполненном лузгой.

Для проведения эксперимента по экстракции была использована фракция лузги расторопши пятнистой, приготовленная из одной партии плодов растения, предоставленной ЗАО «Самаралектравы» (с. Антоновка, Самарская область).

Приготовление лузги расторопши пятнистой осуществлялось следующим образом: проводили измельчение плодов, затем отсеивали лузгу от муки семян расторопши пятнистой на почвенных ситах диаметром ячейки 0,1 – 0,5 мм.

2.4.2 Методика проведения экстракции субкритической водой

Заполнение экстракционного сосуда лузгой семян расторопши пятнистой проводили методом сухого заполнения колонны экстрактора, предварительно на одну часть колонны устанавливали фитинги и фритты. На заполнение экстракционного сосуда требовалось в среднем 11,4 г навески лузги. Затем на открытую часть колонны экстрактора также устанавливали фитинги и фритты. Экстрактор устанавливали в термостат, заполняли подвижной фазой и устанавливали требуемые для опыта температуру и давление.

Затем в течение 20-30 мин выдерживали систему в статическом режиме, после чего процесс экстракции проводили динамическим способом в течение 40-60 мин при расходе подвижной фазы 1 мл/мин, отбирая по 5мл в коллектор фракций с последующим их анализом методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.

2.5 Подготовка хроматографа к работе и проведение

хроматографического анализа

Приготовление подвижной фазы

Для проведения измерений методом ВЭЖХ готовили смесь ацетонитрила с 0,01М раствором фосфатного буфера в объемном соотношении 35:65. Требуемые объемы ацетонитрила и фосфатного буферного раствора отмеряли мерными цилиндрами.

Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил «extra pure» фирмы «MERCK».

Приготовление раствора фосфатного буфера.

0,1М раствор фосфатного буфера готовился путем растворения 13,8 г натрия фосфорнокислого (NaH2PO4·H2O) в 900 см3 бидистиллированной воды, раствор тщательно перемешивали и доводили до 1000 см3. Затем 100 см3 полученного 0,1М буферного раствора разбавляли водой до 1000 см3 и добавляли 2М раствор соляной кислоты до рН=3.

Готовую подвижную фазу дегазировали гелием.

Режим работы хроматографа для определения времени удерживания исследуемых компонентов:

· Температура колонки25оС;

· Скорость потока0,6 мл/мин;

· Объем вводимой пробы20 мкл;

· Длина волны 289 нм

· Время анализа 20 мин.

2.6 Проведение градуировки

Качественный анализ компонентного состава экстрактов проводили по временам удерживания БАС относительно времени удерживания стандартного образца сравнения (силибина) с использованием литературных данных [20, 21].

Количественный анализ силибина проводили методом абсолютной градуировки.

Приготовление градуировочных смесей

Построение градуировочных характеристик (зависимость площади хроматографического пика вещества от его концентрации) осуществляли с использованием государственного стандартного образца (ГСО) силибина (рег. №42-0072-01).

Для приготовления градуировочных растворов силибина 0,02 г ГСО силибина растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл в 80 мл 95%-ного этилового спирта при нагревании (Т=70°С), затем содержимое колбы охлаждали и доводили объем раствора до метки. Далее объемно-весовым методом готовили серию градуировочных растворов силибина в этаноле (0,5 – 50 мг/дм3).

Значения концентраций таксифолина, силикристина и силидианина рассчитывали методом внутреннего стандарта по уравнению:

,(1)

где - площадь хроматографического пика определяемого компонента; - площадь хроматографического пика стандарта (силибина); - концентрация стандарта.

Коэффициенты чувствительности для исследуемых компонентов относительно стандартного вещества силибина равны единице, так как все они имеют одинаковое поглощение при длине волны спектрофотометрического детектора = 289 нм [1].

Построение градуировочных зависимостей

По полученным результатам пяти параллельных измерений для каждого градуировочного раствора стандарта (силибина) были построены градуировочные характеристики, описываемые уравнением

,(2)

где и - входной и выходной сигналы хроматографа соответственно, ‑концентрация компонента в градуировочной смеси; – площадь хроматографического пика; - константа корреляционного уравнения, рассчитываемая методом наименьших квадратов [20]:

,(3)

где m=5 –количество градуировочных растворов; - среднее арифметическое i-х значений выходного сигнала для соответствующей концентрации в растворе.

2.7 Оценка погрешностей измерения определяемых величин

По результатам анализа градуировочных растворов силибина проведена оценка правильности и прецизионности измерения [22]. Для этого рассчитывали абсолютный коэффициент чувствительности для расчета концентрации силибина в исследуемых смесях:

,(4)

где - измеренная концентрация силибина в i-ом градуировочном растворе, - абсолютный коэффициент чувствительности для силибина или тангенс угла наклона зависимости .

1. Правильность измерения, (%) в каждой выборке определяли по уравнению

(5)

где - среднее значение измеренной концентрации в i-ом градуировочном растворе, - истинная концентрация силибина в градуировочном растворе.