Ключевой особенностью реакции, приводящей к аминоацетилированию тРНК, является специфичность участвующих в ней ферментов. Присоединение к тРНК каждой из 20 аминокислот, встречающихся в белках, катализируется определенной аминоацил-тРНК-синтетазой. Фермент должен отличить одну аминокислоту от 19 других и перенести ее к одной или нескольким изоакцепторным тРНК из имеющихся примерно 75 других тРНК. Вспомним при этом, что многие аминокислоты очень сходны по структуре: лейцин, валин и изолейцин; валин и треонин; аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Аминоацил-тРНК-синтетазы должны отличить «свои» тРНК от всех других, несмотря на удивительное сходство их вторичной и третичной структур. Поэтому необходимо, чтобы ферменты обладали очень высокой специфичностью, позволяющей им сделать правильный выбор из столь родственных структур и избежать ошибок при синтезе белка.

Комментарий по поводу структур аминоацил-тРНК-синтетаз и их способности к узнаванию аминокислот и родственных тРНК. Многие аминоацил-тРНК-синтетазы удалось очистить. Некоторые из них состоят из одной полипептидной цепи, другие – из двух или четырех идентичных цепей, каждая мол. массой от 35 до 115 кДа. Некоторые димерные и тетрамерные ферменты состоят из субъединиц двух типов. Четкой корреляции между размером молекулы фермента или характером его субъединичной структуры и специфичностью не существует.

Исследования взаимодействия между аминоацил-тРНК-синтетазами и родственными им тРНК не позволили выяснить природу их высокой специфичности. Большинство работ показало, что специфичность фермента определяется его прочным связыванием с акцепторным концом тРНК, DU-участком и вариабельной петлей. Некоторые ферменты, по-видимому, не распознают антикодоновый триплет и катализируют реакцию аминоацетилирования даже при измененном антикодоне. Однако отдельные ферменты проявляют пониженную активность по отношению к таким модифицированным тРНК и при замене антикодона присоединяют не ту аминокислоту. Следовательно, в некоторых случаях существенным оказывается и взаимодействие с антикодоновой петлей. В любом случае акцепторный конец тРНК должен быть ориентирован так, чтобы каталитический центр фермента смог перенести связанный аминоациладенилат к концевому нуклеотиду тРНК.

В какой-то степени способность фермента присоединять нужную аминокислоту к родственной тРНК зависит от специфического связывания аминокислоты. Однако, если безошибочное распознавание родственных аминокислот невозможно, синтетазы могут исправлять ошибки, происходящие при присоединении. Например, нельзя полностью исключить возможность связывания валина изолейцил-тРНК-синтетазой из-за сходства размера и структуры изолейцина и валина. Дефект в специфичности обнаруживается в первой же реакции: изолейцил-тРНК-синтетаза образует ферментсвязанный валил-аденилат, хотя и с меньшей эффективностью, чем изолейцил-аденилат, однако такой активированный валин не связывается ни с TPHK, ни с тРНК. Вместо этого ферментсвязанный валил-АМР быстро гидролизуется в присутствии тРНК, и образование валил-тРНК предотвращается. Подобный механизм позволяет валил-тРНК-синтетазе различать валин и треонин, а метионил-тРНК-синтетазе отличать треонин от метионина. Очевидно, что аминоацил-тРНК-синтетазы пользуются механизмом коррекции с целью предотвращения неизбежных ошибок в аминоацетилировании тРНК. И напротив, механизм, с помощью которого удалялась бы уже присоединенная к тРНК неправильная аминокислота, отсутствует. В таких случаях аминокислота занимает неправильную позицию в белке. Частота таких ошибок очень низка. В гемоглобине кролика, например, валин оказывается в местах, обычно занимаемых изолейцином, только в одном из 25000–50000 возможных случаев. Таким образом, точность первого шага на сложном пути считывания генетической информации обеспечивается четкой работой разных аминоацил-тРНК.

б. На рибосомах осуществляются спаривание аминоацил-тРНК с кодонами и сборка белковых цепей

Во всех клетках имеются рибосомы, играющие ключевую роль в синтезе белка; их число колеблется от 20000 до 50000 в зависимости от белоксинтезирующей активности клеток. Рибосомы индифферентны в отношении синтезируемых ими белков или тех клеточных мишеней, к которым они направляют синтезированные продукты. Тип синтезируемого рибосомой белка в каждом синтетическом цикле диктуется мРНК, с которой рибосома оказалась связанной. Внутри- или внеклеточная локализация белков определяется их структурными особенностями и – в зависимости от этих особенностей – характером взаимодействия со специализированными мембранами и органеллами.

Рибосомы про- и эукариот обладают в общем очень сходными структурой и функциями. Тем не менее из-за различий в структуре и организации про- и эукариотических мРНК и из-за того, что процессы транскрипции и трансляции у эукариот являются сопряженными во времени и в пространстве, тонкие различия между рибосомами про- и эукариот имеются. Типичными прокариотическими рибосомами являются рибосомы Е. coli, и поскольку их структура и функции изучены лучше остальных, мы используем эту модель в последующем обсуждении. Для сравнения мы остановимся на некоторых структурных особенностях рибосом эукариот.

Строение рибосомных частиц. Рибосомы прокариот состоят из малых и больших субчастиц. 30S-субчастицы состоят из единственной молекулы рРНК размером 1542 нуклеотида и 21 белка с разной мол. массой. 50S-субчастицы содержат две рРНК – большую, состоящую из 2904 нуклеотидов, и более мелкие, из 120 нуклеотидов; они связаны с 34 разными белками. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности всех рРНК и белков известны. Электронно-микроскопические исследования 70S-рибосом и построения их трехмерных моделей показали, что малая и большая субчастицы соприкасаются в нескольких точках, но самой характерной особенностью является наличие бороздки между ними, необходимой, по-видимому, для размещения в ней мРНК на время трансляции.

И малая, и большая рибосомные субчастицы могут диссоциировать на составляющие молекулы РНК и белка. Более того, даже после отделения друг от друга молекулы всех РНК и белков способны восстанавливать исходную функционально активную рибосомную субчастицу, если их смешать в соответствующих условиях. Это означает, что вся информация о сборке мультимерного комплекса заключена в структуре его компонентов. Эксперименты по реконструированию рибосом позволяют лучше понять характер взаимодействия между этими компонентами и определить возможный порядок, в котором собираются белки и РНК in vivo. Кроме того, в подобных экспериментах можно проверить совместимость эквивалентных РНК или белковых субчастиц из различных источников. Далее, с помощью этого метода можно оценить способность мутантных РНК или белков к взаимодействию с восстановлением структуры рибосом и проявлению различных видов активности, присущих реконструированным рибосомам.

Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле, также состоят из малых и больших субчастиц. Малые субчастицы содержат одну молекулу РНК размером 1900 нуклеотидов и 30–35 белков; большие – три цепи РНК длиной 120, 160 и 4800 нуклеотидов и 45–50 белков. Рибосомы митохондрий и хлоропластов отличаются от цитозольных рибосом. Как правило, они меньше и содержат меньшее количество белков и различных рРНК. Данные по физическому и химическому реконструированию более сложных эука-риотических хромосом значительно уступают аналогичным данным, полученным для Е. coli.