Второй вопрос: как обеспечивается независимость хода часов от температуры? Ход часов не должен зависеть от температуры. Уж очень непостоянна температура среды обитания. Независимость от температуры – очень трудное условие поиска: все химические процессы и большинство физико-химических процессов сильно зависят от температуры.

Третий вопрос: как осуществляется преобразование высокочастотного процесса в низкочастотный? В наших механических часах преобразования от секундных колебаний маятника (секундная стрелка делает оборот за 1 мин) к движению минутной стрелки (оборот за 1 ч) и 12-часовому обороту часовой стрелки осуществляются посредством делителей частоты – системы шестеренок. Как в биологических часах осуществляется преобразование околосекундных колебаний в околосуточные?

Четвертый вопрос: как происходит регулировка и подстройка часов относительно внешних периодических процессов («сигналов точного времени»)? Должны быть «рецепторы», воспринимающие эти внешние сигналы, например световые импульсы.

Остается еще много важных вопросов и среди них такой: как осуществляется «временная организация» – согласование всех внутриклеточных часов многоклеточного организма? Такое согласование предполагает какую-то систему сигнализации между клетками. А тогда возникают новые вопросы: что за сигналы посылают они друг другу? Как достигается иерархия – подчинение часов одних клеток сигналам часов других, «руководящих», клеток? Где в клетке находятся часы? Где в многоклеточном организме со сложной анатомией находятся главные часы?

Исследованием природы биологических часов заняты лаборатории в разных странах. Здесь работали и работают выдающиеся исследователи: «классики» Фриш, Бюннинг, Питтендрич, Хастингс, Халберг, и много новых, относительно молодых биологов, физиков, математиков. Далеко не на все перечисленные вопросы получены ответы, и все же успехи здесь замечательны.

Биохимические колебательные процессы и внутриклеточные часы

Итак, мы должны определить природу внутриклеточного периодического процесса, не зависящего от температуры, имеющего период порядка секунд, колебания которого преобразуются в околосуточные. Процесс этот должен настраиваться по внешним ритмам (свет–темнота) и по сигналам, идущим от других клеток многоклеточного организма.

В середине 1950-х гг. мысль о возможности существования колебательных, периодических химических (биохимических) реакций казалась очень странной. Как это может быть, чтобы в химической реакции все молекулы реагировали то с одной скоростью, то с другой, т.е. были бы все то в одном, то в другом состоянии? Казалось, что это допущение противоречит законам термодинамики.

И в самом деле, в равновесии колебания невозможны. Но колебательные процессы осуществляются лишь до тех пор, пока системы неравновесны, пока не израсходована их свободная энергия. Пока концентрации реагентов неравновесны, колебательные режимы вполне возможны. Но это простое соображение долго не осознавалось даже очень образованными людьми. Поэтому, когда работавший в секретном учреждении военный химик генерал Борис Павлович Белоусов послал в 1951 г. в редакцию одного из журналов статью с описанием открытой им периодической реакции, статью ему вернули с обидной рецензией: такого не может быть!

А реакция, открытая Б.П. Белоусовым, замечательная – в растворе серной кислоты малоновая, лимонная, яблочная кислоты окисляются в реакции с KBrO3 в присутствии катализатора – ионов церия (или марганца, или железа). Если для большей наглядности в реакционную среду добавить комплекс железа и фенантролина, цвет раствора периодически изменяется от ярко-синего до красно-лилового и обратно. Глаз не отведешь! Наблюдающие эту реакцию даже дышать начинают невольно в такт изменениям цвета. Но рецензенты были настолько убеждены, что этого быть не может, что не захотели поставить несложный опыт. Зачем, когда и так ясно .

Ко времени открытия Б.П. Белоусова математическая теория колебательных реакций была уже создана (в 1910 г. Альфредом Лоткой). У нас в стране выдающиеся физики Л.И. Мандельштам, А.А. Андронов и их последователи создали общую теорию колебаний. Д.А. Франк-Каменецкий и И.Е. Сальников открыли и описали колебательные процессы в реакторах, когда происходят не только химические превращения, но и диффузия и передача тепла на стенках реактора. Все это могло служить моделями внутриклеточных колебательных процессов. Оставалось «немногое» – найти их в клетках.

Сообщения об открытии биохимических колебательных процессов начали появляться с конца 1950-х гг. (в том числе из нашей лаборатории). Однако первый бесспорно периодический биохимический процесс открыл выдающийся американский биохимик Бриттен Чанс.

Во всех клетках превращения энергии связаны с синтезом и гидролизом АТФ. Самый распространенный процесс, в котором в темноте и без кислорода образуется АТФ, – это гликолиз, когда происходит расщепление молекулы глюкозы на две молекулы молочной кислоты или на две молекулы этилового спирта и две молекулы СО2 (тогда этот процесс называется брожением). Гликолиз – это последовательность многих реакций, каждая из которых катализируется своим ферментом. Центральная реакция гликолиза (в ней фруктозо-6-фосфат превращается во фруктозо-1, 6-бифосфат) катализируется ферментом фосфофруктозокиназой. Вот в этой реакции и были обнаружены колебания скорости. Следовательно, и синтез АТФ должен был осуществляться с колебаниями скорости: то быстрее, то медленнее. И колебания были «вполне подходящие», с периодом порядка минуты, т.е. вполне годились на роль маятника биологических внутриклеточных часов.

Казалось, что механизм биологических часов – их маятник – найден. Однако вскоре наступило разочарование. Эти колебания в гликолизе идут лишь в особых условиях и, кроме того, сильно зависят от температуры. А часы от температуры зависеть не должны. В разных лабораториях продолжали поиск.

Гликолиз – это бескислородное окисление глюкозы, дающее всего две молекулы АТФ на одну молекулу превращенной в молочную кислоту глюкозы. А в митохондриях, осуществляющих внутриклеточное дыхание, образуется 34 молекулы АТФ на каждую окисленную до CO2 и H2O молекулу глюкозы. Вот если бы здесь был колебательный процесс, он должен был бы быть значительно более эффективным часовым механизмом.

Колебания в митохондриях были найдены – М.Н. Кондрашовой и Ю.В. Евтодиенко в лабораториях Института биофизики в Пущино. В ходе этих колебаний в митохондрии то входят потоки ионов калия, кальция или водорода, то выходят. Скорость поглощения кислорода митохондриями также периодически изменяется. Теперь найден механизм, точнее маятник, часов? К сожалению, нет. Все еще было не ясно – происходят ли эти колебания, как должно быть в часах, всегда, или только в определенных создаваемых в эксперименте условиях. И, опять же, выяснилось, что они сильно зависят от температуры.

Пришлось задуматься: следует ли искать механизм часов в процессах, обеспечивающих клетки энергией? Все больше данных свидетельствовало в пользу того, что часы идут в полном покое, когда энергия почти не расходуется, так же, как и при активной жизнедеятельности.