Культуры, гидролизующие эфирные связи без побочных реакций, обнаружены в разных таксономических группах. Очень интенсивно проводят реакцию дезацетилирования представители видов Actinomucor corymbosus, Mucor lamprosporus, Actinomyces flavis, A. pheochromogenes, Nocardia sp. и Arthrobacter simplex. Выход реакций достигает 95%. [3]

2.2.6 Отщепление боковых цепей стероидов.

Представляет огромный интерес как путь получения ценных продуктов из относительно дешевых природных стероидов животного и растительного происхождения — стеринов, желчных кислот, сапогенинов.

Возрастающая потребность в производстве стероидных препаратов, а также истощение сырьевой базы делает все более актуальным поиск новых источников сырья. Стоимость диосгенина, получаемого из различных видов диоскореи, за последние годы возросла более чем в 10 раз в результате истощения запасов этих растений. В связи с этим возрос интерес к более доступным природным стеринам.

Основная трудность при использовании фитостеринов заключается в необходимости селективного удаления насыщенной алифатической боковой цепи с сохранением целостности стероидного скелета. Удовлетворительных методов химического расщепления до сих пор не удалось разработать, перспективными считаются лишь микробиологические способы. Однако промышленный интерес представляют только процессы расщепления боковой цепи, не затрагивающие стероидного ядра.

Проблема расщепления боковой цепи стеринов с сохранением стероидного скелета может быть решена следующими способами:

1) синтезом модифицированных стеринов, заместители в кольце А или В которых не позволяют микроорганизмам осуществлять 1,2-дегидрирование или 9-гидроксилирование;

2) инкубацией стеринов в присутствии соединений, ингибирующих действие ферментов 9-гидроксилазы или 1,2-дегидрогеназы,

3) получением мутантных штаммов, не способных осуществлять определенные стадии расщепления самого стероидного ядра.

Эти три способа, а иногда и их комбинации в сочетании с оптимальными условиями режима ферментации позволили получить из ряда стеринов большой спектр промежуточных соединений, применяемых для химического синтеза высокоактивных стероидных препаратов.

3. Методы проведения процессов микробиологических трансформаций

Несмотря на разнообразие биотрансформаций стероидов, методы проведения микробиологических реакций довольно единообразны. При поисковых работах, где не требуется или нет возможности применять большие количества вещества, ограничиваются проведением реакции в колбах на качалках, загрузка стероида в колбу составляет 100—200 мг. Для загрузок порядка 1—2 г стероида применяют стеклянные ферментеры. В промышленности и на опытных установках применяют стальные аппараты, оборудованные аэрирующими и перемешивающими устройствами.

Собранный стеклянный ферментер стерилизуют и загружают стерильной питательной средой с заранее внесенной в нее в асептических условиях трансформирующей культурой. Особое внимание уделяют соблюдению асептики во всех операциях. Стерилизацию в зависимости от объекта осуществляют автоклавированием питательной среды при 110—120°С в боксах, освещаемых бактерицидными лампами. Операции по загрузке, отбору проб проводят в пламени газовой горелки. Загрузка питательной среды в ферментер, как правило, осуществляется передавливанием стерильным сжатым воздухом. Время роста культуры микроорганизма-трансформатора определяется появлением максимальной трансформирующей активности и может колебаться от нескольких часов для одних культур до нескольких суток для других. Для многих культур-трансформаторов характерна максимальная трансформирующая активность в период снижения удельной скорости роста культуры.

Растворимость стеринов в воде очень низка. В настоящее время стерины, предназначенные для окисления, в небольшой концентрации (порядка 1 г/л) вносят растворенными в малотоксичном, смешивающемся с водой растворителе (ацетоне, спирте, диметилформамиде). При более высоких концентрациях стеринов (выше 1 г/л) их вносят в среду в виде мелкоизмельченной пудры; для этого кристаллы стерина растирают в специальной аппаратуре или разрушают ультразвуком.

Другой способ внесения стеринов для биотрансформации состоит в том, что стерин, например -ситостерин, растворяют в смеси гептан/этиленхлорид, добавляют при перемешивании воду и отгоняют растворитель нагреванием смеси до 95°С. При таком методе концентрация ситостерина в водной суспензии может достигать 140 г/л.

Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их использовании в качестве источника углерода, поэтому стимуляция роста трансформирующих штаммов должна приводить к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в питательную среду некоторых масел в количестве 1—3 мас.% (соевого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с применением глицеридов животного и растительного происхождения (тристеарин, триолеин, трипальмитин). Механизм стимуляции роста глицеридами, вероятно, состоит в устранении гидрофобности стеринов, т. Е. глицериды действуют так же, как неионные ПАВ (твин), обычно применяемые для микробиологических процессов трансформации. Температурный режим микробиологических трансформаций стероидов не отличается от принятых для других микробиологических процессов и составляет 24—33°С. Условия рН определяются при отборе штамма культуры-трансформатоа и колеблются в широком интервале.

Микробиологический контроль осуществляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры. Аналитический контроль реакции трансформации ведется путем отбора проб через определенные временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» — исходного стероида, целевого продукта трансформации и некоторых промежуточных и побочных продуктов, если они участвуют в данном процессе.

После завершения трансформации культуральная жидкость, отделенная от мицелия (или другой биомассы), экстрагируется несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригодным для растворения соответствующего стероида (этилацетат, метиленхлорид или хлороформ). Экстракт, отделенный от водной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси обычно отделяют обработкой с активированным углем, затем уголь отфильтровывают); далее его концентрируют в вакууме и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подходящего растворителя. В препаративных целях при работе с небольшими количествами стероидов очистку продукта трансформации можно проводить методом колоночной хроматографии.

Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24—30°С. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.