Полученная плазмида была рестриктирована по Ascl и котрансформирована с геномом вируса CELO по гомологичным участкам. Таким образом нами был получен Ad-вектор для экспрессии генов на основе генома аденовируса птиц CELO. Указанная схема представлена на рисунке 2.1.

2

2.3 Обработка экспериментальных данных

Плазмида с измененным ori была подвергнута наращиванию в Е. coli препаративных количествах. Для доказательства идентичности полученных плазмид с исходной был проведен рестрикционный анализ. В лунки 0.8% агарозного геля были внесены следующие пробы: в первую—маркер молекулярного веса (геном фага X, разрезанный рестриктазой РСТ, см. рисунок 2, б));

во вторую — плазмида, нарощенная в препаративных количествах; в третью - первоначально полученную плазмиду. По результату электрофореза, представленному на рисунке 2.2, можно судить об идентичности молекулярного состава указанных плазмид.

Плазмида, полученная после рекомбинации с геномом CELO и имеющая 48 тысяч пар оснований, была подвергнута обработке рестриктазой HindHI. Указанная рестриктаза активна при следующей комбинации нуклеотидов:

Количество сайтов рестрикции в полученной плазмиде и их местоположение указаны на рисунке:

Пробы после рестрикции были подвергнуты электрофорезу. В первую, вторую и третью лунку помещены целевые плазмиды, полученные из разных клонов Е. coli. В четвертую лунку помещена плазмида, неподвергавшаяся рестрикции, в пятую — маркер молекулярного веса.

Результаты рестрикционного анализа свидетельствуют об идентичности полученных фрагментов с ожидаемыми.

Заключение

В заключении данной работы рассмотрим наиболее существенные и практически значимые достижения рекомбинантной ДНК-биотехнологии, а также перспективы её развития.

Начиная с момента открытия двойной спиральной структуры а особенно после расшифровки генома человека, научные изыскания приносят значительные практические результаты, наиболее перспективные из которых следующие: конструирование рекомбинантных организмов-продуцентов жизненно необходимых лекарственных средств, получение которых альтернативными методами невозможно или сопряжено со значительными трудностями; разработка генетических вакцин; развитие генной терапии; применение трансгенных растений и животных для интенсификации сельского хозяйства.

Сравнение структур генов секвенированных к настоящему времени геномов человека, дрозофилы нематоды, дрожжей и бактерий приводит к выводу, что все живые существа действительно произошли от общего предшественника, так как родственные гены легко идентифицируются в геномах представителей всех трех царств живых организмов. Указанный факт теоретически обосновывает возможность встраивания и успешного функционирования чужеродных генов в организме. В настоящее время широкий спектр биологически активных веществ производится рекомбинантными организмами (соматотропин, инсулин, интерфероны, интерлейкин - 2).

Одним из самых современных и перспективных направлений биотехнологии является разработка генетических вакцин. Преимуществом генетических вакцин является возможность фокусирования иммунного ответа на одном или нескольких определенных антигенах возбудителя, что принципиально невозможно при использовании традиционных вакцин и не происходит при течении инфекционного процесса, а также возможность их использования не только в превентивных, но и в терапевтических целях для лечения аутоиммунных заболеваний, аллергий и злокачественных новообразований.

К терапии нового поколения относится генная или клеточная терапия основанная на превращении стволовых клеток в любые другие необходимые для организма клетки. В настоящее время указанная выше методика находится в стадии разработки, но имеет реальную перспективу.

Литература

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки в 3-х томах. — М.: Мир, 1994. — 1558 с. — ISBN 5-03-001986-3.

2. Докинз Р. Эгоистичный ген. — М.: Мир.[82]

3. История биологии с начала XX века до наших дней. — М.: Наука, 1975. — 660 с.

4. Льюин Б. Гены. — М.: Мир, 1987. — 1064 с.

5. Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг лямбда. — М.: Мир, 1989. — 160 с.[83]

6. Уотсон Дж. Д. Двойная спираль: воспоминания об открытии структуры ДНК. — М.: Мир, 1969. — 152 с.

7. Burgers P, Koonin E, Bruford E et al. (2001). «Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature». J. Biol. Chem. 276 (47): 43487-90. PMID 11579108

8. Авторозов Е.К. Лекции по микробиологии и биотехнологии – М.: Эксмо, 2000

9. Елинов М.П. Основы биотехнологии – М.: Москва, 2004

10. Егорова Н.С. Биотехнология. Учебное пособие для ВУЗов – М.: Просвещение, 2009.