Для приготовления желточной эмульсии на дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, тщательно протирают его ватой, смоченной этиловым спиртом, и обжигают. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон яйца два отверстия, через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу вместимостью 200 см3. К желтку постепенно добавляют (частями по 20–30 см3) 200 см3 стерильного изотонического раствора, содержимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.

Для приготовления желточно-солевого агара на 1 дм3 стерильного расплавленного и остуженного до (45±1)°С солевого агара добавляют 200 см3 желточной эмульсии, после полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20–25 см3 и хранят в холодильнике до 5–7 сут.

Приготовление реактива Эрлиха

В 50 см3 этилового спирта с массовой долей 96% растворяют 4 г парадиметиламидобензальдегида, затем медленно добавляют 50 см3 концентрированной соляной кислоты. Реактив хранят в склянке из темного стекла при температуре 4–8°С.

Бумага индикаторная для обнаружения индола

Листы фильтровальной бумаги и обильно смачивают горячим насыщенным (12%) раствором щавелевой кислоты, высушивают при температуре (23±2)°С, затем нарезают полосками шириной 0,2–0,4 мм, длиной 5 – 6 см и хранят в банках темного стекла под пробками.

Карболовый раствор кристаллического фиолетового или генциан фиолетового

1г кристаллического фиолетового или генциан фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями приливают 10 см3 этилового спирта с массовой долей 96%. Раствор фильтруют через влажный бумажный фильтр. Растворы генциан фиолетового или кристаллического фиолетового нестойки, длительному хранению не подлежат.

Красящие бумажки с кристаллическим фиолетовым или генциан фиолетовым для окраски по Граму, в модификации Синева

Кристаллического фиолетового или генциан фиолетового – 1 г, спирта этилового с массовой долей 96% – 100 см3, глицерина – 5 см3 смешивают, наливают в лоток или глубокую тарелку. Бумаг нарезают в виде полосок шириной 2 – 2,5 см и длиной 30 – 50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краситель так, чтобы смачивались обе ее поверхности. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают красителю стечь и подвешивают на веревке для высушивания. Бумагу сушат в термостате при температуре (37±1)°С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2˟2 или 2˟4,5 см.

Раствор Люголя для окраски мазков по Граму

2 г йодида калия растворяют в 10 см3 дистиллированной воды, прибавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода, после чего доливают 290 см3 дистиллированной воды. Раствор хранят в химической посуде из темного стекла.

Фуксин Циля – карболовый раствор

1 г порошка фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см3 (несколько капель) глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 этилового спирта с массовой долей 96%. После того, как смесь полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды, выдерживают 2 сут, после чего фильтруют. Фуксин Циля стойкий, хранится долгое время во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин Пфейфера, спирто-водный раствор

К 1 части карболового раствора фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят в необходимых количествах непосредственно перед использованием.

Сухие среды: питательный агар, висмут-сульфитный агар, Гисса, дрожжевой экстракт, Кесслер. желчь крупного рогатого скота, мясо-пептонный бульон, Плоскирева, селенитовую, Хейфеца, агар Эндо, агар Клиглера готовят по прописи, указанной на этикетке.

Приготовление мазков по методу Грома

Приготовление мазков из культуры в агаризованной среде

На середину чистого обезжиренного предметного стекла стерильной пипеткой или петлей наносят небольшую каплю стерильного изотонического раствора или водопроводной воды. Затем, соблюдая правила асептики, петлей с плотной питательной средой из пробирки или чашки берут испытуемую колонию. Часть ее погружают в каплю, слегка растирая в ней, а остаток в петле сжигают на пламени горелки. Остуженной петлей сначала краем, а потом всей плоскостью петли равномерными круговыми движениями распределяют каплю на площади, составляющей примерно 1/3 предметного стекла.

При приготовлении препарата из культуры в жидкой питательной среде бактериологической петлей или пастеровской пипеткой берут каплю культуры и, поместив ее на середину сухого чистого стекла, равномерно распределяют ее в форме мазка. Петлю тотчас же обжигают на пламени горелки, а пастеровскую пипетку погружают в дезинфицирующий раствор.

Приготовленные мазки высушивают при комнатной температуре на воздухе.

Высушенные мазки фиксируют, для чего препарат берут пинцетом за край стекла мазком вверх и несколько раз проводят его через пламя горелки.

Окраска мазков

На предварительно фиксированный пламенем мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной кристаллическим фиолетовым или генциан фиолетовым, и на последнюю наливают дистиллированную воду так, чтобы бумажка полностью смочилась краской. Прокрашивание длится 1–2 мни.

Фильтровальную бумажку снимают пинцетом, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают на него раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.

Раствор Люголя сливают, предметное стекаю для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик с этиловым спиртом с массовой долей 96%. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости. Мазок можно обесцвечивать и таким способом: на препарат начинают этиловый ректификованный спирт с массовой долей 96% на 30 – 60 с, при этом препарат покачивают и доливают спирт.

Препарат тщательно промывают водопроводной водой и докрашивают спиртоводным раствором фуксина (Пфейфера) или 1 %-ным водным раствором нейтрального красного в течение 1–2 мин. Краску сливают, мазок промывают водопроводной водой, сушат на воздухе или фильтровальной бумагой и микроскопируют. При этом учитывают морфологические особенности изучаемых бактерий и их отношение к окраске: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-розовый цвет.

Порядок проведения контроля

Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Метод основан на подсчете всех колоний мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре, и пересчете их количества на 1 г сухого (1 см3 жидкого) яичного продукта.

Проведение контроля

По 1 см3 исследуемого продукта из приготовленных разведений, высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают, и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 мин после внесения исследуемого материала в чашки его заливают 15 – 20 см3 предварительно расплавленного и охлажденного до (45±1)°С питательного или мясо-пептонного агара. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды. Чашки с посевами, перевернутые вверх дном, инкубируют в термостате при температуре (30±1)°С в течение (72±3) ч.