Обычно тандемная масс-спектрометрия проводится столкновением выбранного иона с молекулами инертного газа, такого как аргон или гелий, и последующим анализом образовавшихся фрагментов. Тандемный анализ масс используется для определения последовательности пептидов, структурных характеристик углеводов, малых олигонуклеотидов и липидов.

Термин «тандемный» анализ масс применяется для событий, последовательных в пространстве или во времени. Тандемный анализ масс в пространстве проводится последовательно расположенными анализаторами, тогда как тандемный во времени анализ масс осуществляется в одном и том же анализаторе, который отделяет нужный ион, фрагментирует его и анализирует фрагментарные ионы. Характеристики тандемного анализа для различных анализаторов приведены в таблице 2.2.

Скорость сканирования

Эта характеристика показывает скорость, с которой анализатор сканирует конкретный диапазон масс. Большинству приборов необходимо несколько секунд для полного сканирования, однако это время может сильно разниться в зависимости от анализатора. Времяпролётные анализаторы, например, совершают анализ в миллисекунды и даже быстрее. [12]

Конкретные виды анализаторов

Как известно, ESI и MALDI, например, генерируют ионы довольно различными способами. ESI Создаёт ионы в непрерывном потоке заряженных капель при атмосферном давлении, и ионы также создаются непрерывным потоком, по этим причинам квадрупольные анализаторы являются наиболее подходящими для ESI, так как они оба устойчивы к довольно высоким давлениям (~10-5 Торр) а и способны к непрерывному сканированию потока ионов из ESI. MALDI, с другой стороны, образует ионы посредством коротких, наносекундных, импульсов и хорошо совместимо с времяпролётным анализатором, который измеряет точно синхронизированные пакеты ионов, такие, как, например, полученные при помощи лазерного импульса.

Квадрупольный анализатор

Квадрупольный анализатор масс (рис. 2.3) используется с EI-устройствами с 1950-х и до сих пор является самым распространённым анализатором. Интересно, что квадрупольные анализаторы оказались очень удобными для совмещения с ESI и APCI. Квадруполи имеют три основных достоинства. Они устойчивы к относительно высоким давлениям.

Во-вторых, квадруполи имеют значительный диапазон масс – они способны к анализу до m/z порядка 4000, что удобно, так как ионизация электроспрея белков и других биомолекул обычно дают такое распределение заряда, что m/z лежит в пределах от 1000 до 3500. Наконец, квадрупольные масс-спектрометры являются относительно дешёвыми приборами. Учитывая взаимно дополняющие особенности ESI и квадруполей, неудивительно, что первый успешный коммерческий прибор электроспрея был оснащён квадрупольным анализатором масс.

Квадрупольные анализаторы параллельно соединены с радиочастотным (RF) генератором и постоянной разностью потенциалов (DC). При определённой частоте RF, только ионы с соответствующим m/z могут пройти через квадруполь, как показано на рис. 2.3, где только ионы с m/z 100 детектируются. Во всех трёх случаях на рис. 2.3 DC и RF поля одинаковы. Поэтому сканированием RF поля может быть анализирован широкий m/z - диапазон (обычно от 100 до 4000) приблизительно за одну секунду.

Для проведения тандемного анализа масс с квадрупольным прибором,

необходимо разместить три квадруполя в ряд. Каждый квадруполь иг

рает отдельную роль: первый квадруполь (Q1) используется для сканирова

ния определённого m/z диапазона и выбора нужного иона; второй квадруполь

(Q2), также известный как ячейка столкновения, фокусирует и пропускает

ионы через подаваемый на путь пролёта вспомогательный газ (аргон или ге

лий); третий квадруполь (Q3) служит для анализа фрагментарных ионов, ге

нерированных в ячейке столкновения (Q2) (рис. 2.4). Последовательная схе

ма вызванной столк новением ионизации (CID) показана на схеме 2.1.

Квадрупольная ионная ловушка

Анализатор ионной ловушки показан на рис. 2.5 (реальным размером примерно с теннисный мяч) был придуман в то же время, что и квадрупольный анализатор масс, тем же человеком, Вольфгангом Паулом. Кстати, физика в основе обоих этих анализаторов сходна. Однако в ионной ловушке, вместо того, чтобы проходить через квадрупольный анализатор с наложенным радиочастотным полем, ионы ловятся в такое квадрупольное поле. Один из методов использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов непосредственно внутри при помощи EI, с последующим анализом масс. Другой, более популярный, метод использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов во внешнем устройстве при помощи ESI или MALDI и использование ионной оптики для введения образца в объём ловушки. Квадрупольная ионная ловушка обычно состоит из кольцевого электрода и двух гиперболических закрывающих электродов (рис. 2.5). Движение ионов, вызванное электрическим полем этих электродов, позволяет поймать или выпустить ионы из ловушки. В нормальном состоянии, радиочастота сканируется, чтобы резонансно возбудить и, вследствие этого, выпустить ионы через маленькие отверстия в «крышках» детектора. По мере того, как сканирование RF достигает более высоких частот, ионы с более высоким m/z возбуждаются, выпускаются и детектируются.

Очень полезной особенностью ионных ловушек является то, что они способны изолировать один вид ионов, выпустив все остальные из ловушки. Изолированные ионы могут быть, затем фрагментированы посредством столкновений, а фрагменты проанализированы. Основное преимущество квадрупольных ионных ловушек – то, что эксперимент с диссоциацией, вызванной многократными столкновениями, может быть проведён быстро без использования дополнительных анализаторов, так, что LC-MS/MS в реальном времени сейчас является обычным делом. Другими важными преимуществами квадрупольных ионных ловушек являются малые размеры и их способность ловить и накапливать ионы для обеспечения лучшего ионного сигнала. Квадрупольные ионные ловушки были приспособлены для ряда различных целей: от EI-MSn (рис. 2.5) биомолекул до их более современных совмещений с MALDI. MSn позволяет многократным MS/MS экспериментам проводиться с последовательными фрагментарными ионами, давая дополнительную фрагментарную информацию. Но главнейшим применением ионных ловушек является определение белков. LC-MS/MS эксперименты проводятся для белковых гидролизатов, давая информацию одновременно по MS и MS/MS. Эта информация позволяет идентифицировать белки и характеризовать пост-трансляционную модификацию. Диапазон масс (~4000 m/z) коммерческих LC-ловушек хорошо соответствует значениям m/z, генерируемым ионизацией электроспрея пептидов, а разрешение позволяет идентифицировать зарядное состояние многозарядных ионов пептидов. Масс-спектрометры квадрупольной ионной ловушки могут анализировать пептиды из трипсинового гидролизата при их содержании порядка 20-100 фмоль. Другим ценным качеством техники ионной ловушки для анализа пептидов является её способность проводить несколько стадий масс-спектрометрии, которые значительно увеличивают количество структурной информации. [13]