Рис. 19. Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней Уф-области: А – Х-белка;

Б – С-белка; В – Н-белка; Г – тайтина. Спектры КД молекулярных форм Х-, С-, Н-белков (в растворе, содержащем 0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и молекулярной формы тайтина (0.6 М KCl, 30 мМ KH2PO4, рН 7.0) показаны линией красного цвета. Спектры КД фибрилл Х-, С-, Н-белков и тайтина (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5) показаны линией синего цвета.

Понятно, что при наличии у этих белков β-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидных фибрилл, облегчается процесс формирования ими амилоидов in vitro и увеличивается опасность их быстрого роста в клетке.

4.5. Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка

Процессы формирования амилоидных фибрилл разными белками in vitro характеризуются разной скоростью (Kim et al., 2002; Stine et al., 2003; Hwang et al., 2004). Скорость фибриллообразования может зависеть от многих факторов: состава растворов, температуры, рН, и др. Но наибольшее влияние оказывает, скорее всего, тип вторичной структуры белка. Если белок содержит высокий процент α-спирали, то требуется трансформация типа "α-спираль – β-складчатость" (рис. 4). Так как белки семейства тайтина уже содержат β-складчатую структуру, то нет необходимости в изменении вторичной структуры. Скорость образования амилоидных структур белками семейства тайтина была продемонстрирована на примере Х-белка, так как он образует наиболее упорядоченные амилоидные структуры и методом электронной микроскопии можно визуально оценить, как происходит процесс фибриллообразования. Параллельно скорость образования амилоидных фибрилл Х-белком оценивалась по их связыванию с флуоресцентным красителем тиофлавином Т, который широко используется в качестве маркера амилоидов (LeVine, 1993).

В образцах белка происходило накопление их амилоидных структур, о чем свидетельствует возрастание флуоресцентного сигнала тиофлавина Т. Результаты представлены на рис. 20. Не происходит значительного увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при связывании с Х-белком в первые часы инкубации (1–4 часа), так как фибриллы еще не сформированы, а присутствуют аморфные агрегаты (рис. 20 А). При дальнейшей инкубации интенсивность флуоресценции тиофлавина Т возрастала (рис. 20 Г), что соответствовало образованию амилоидных фибрилл, среди которых наблюдаются и аморфные агрегаты (рис. 20 Б). После 22 часов диализа интенсивность флуоресценции красителя при связывании с фибриллами достигала плато флуоресцентной кривой, что согласуется с данными электронной микроскопии: отмечается присутствие хорошо сформированных спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (рис. 20 В). Они наблюдаются и после 26 часов диализа.

Рис. 20. А – аморфные агрегаты Х-белка (4 часа диализа), Б – линейные фибриллы и аморфные агрегаты Х-белка (17 часов диализа), В – спирально скрученные ленточные фибриллы Х-белка (22 часа диализа), сформированные в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0. Негативное окрашивание 2% раствором уранилацетата. Шкала 100 нм. Г – скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка.

Для многих амилоидогенных белков также характерна временная зависимость образования амилоидных фибрилл. Например, мышечная ацилфосфатаза способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации в присутствии трифлуороэтанола при рН 5.5 и температуре 25˚С, и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999). Аβ(1-40)-пептид при рН 7.2, температуре 37˚С в присутствии 0.1% уксусной кислоты после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты и только после 48 часов – длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003). Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа "α-спираль – β-складчатость", что, как правило, требует длительной инкубации и жестких условий, не совместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Согласно результатам нашего исследования, образование амилоидных фибрилл Х-белком происходит в мягких условиях (рН 7.0, температура 3–5°С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае мышечной ацилфосфатазы человека и Аβ(1-40)-пептида. Следует также отметить, что в отличие от других белков, наличие 90% β-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo.

4.6. Образование амилоидных фибрилл С-белком миокарда человека при ДКМП и С-белком миокарда кролика

Амилоидные депозиты нередко обнаруживаются в сердце и кровеносных сосудах при кардиомиопатиях и миокардитах. Особо следует отметить амилоидоз сердца (кардиопатический амилоидоз или амилоидная кардиомиопатия), который, как утверждают медицинские специалисты (Сторожаков и др., 2000), к сожалению, не включается в схему дифференциального диагноза даже при резистентной к лечению сердечной недостаточности и диагностируется посмертно. Учитывая все перечисленное выше, мы решили проверить, может ли С-белок, выделенный из сердца пациента с дилатационной кардиомиопатией, образовывать амилоидные фибриллы. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) – заболевание миокарда неизвестной этиологии, диагностирующееся по расширению (дилатации) левого, правого или обоих желудочков. Нарушается систолическая функция желудочков, возможно развитие застойной сердечной недостаточности, часто наблюдается нарушение ритма желудочков и предсердий. В ходе развития ДКМП сердце постепенно, но необратимо, теряет свою функциональную активность (Хубутия, 2001; Шумаков и др., 2003).

Наши исследования показали, что в разных растворах (30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.01 М К-фосфат, pH 7.0; 30 мМ CaCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 50 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0) С-белок миокарда человека образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной до 3 мкм и шириной до 500 нм (рис. 21 Г).

С-белок миокарда кролика в тех же условиях образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной более 2 мкм и шириной до 500 нм (рис. 21 А–В). Амилоидная природа фибрилл С-белка миокарда человека и кролика была подтверждена поляризационной и флуоресцентной микроскопией, а также спектральными методами при взаимодействии их с Конго красным и тиофлавином Т (Марсагишвили и др., 2006).

Таким образом, с помощью разных специфических тестов мы показали, что белки семейства тайтина способны формировать амилоиды in vitro. Дальнейшие наши исследования должны быть направлены на тестирование токсических свойств амилоидов этих белков, на поиск подходов к их разрушению и предотвращению их образования.