Однако не все переносчики работают столь медленно. Анионный переносчик белок полосы 3 из эритроцитарной мембраны играет важную физиологическую роль в усилении быстрого трансмембранного обмена С1 - на НСО3-. Одна из функций эритроцитов заключается в усилении транспорта СО2 от различных тканей к легким. В венозных капиллярах СО2 быстро диффундирует через эритроцитарную мембрану. В клетке под действием карбоангидразы СО2 превращается в Н2СО3, затем быстро устанавливается равновесие Н2СО3 ↔ Н+ + НСО3 - , и анион бикарбоната переносится через мембрану в плазму крови белком полосы 3. В результате по мере того, как эритроцит проходит по капиллярам, концентрация НСО3 - в плазме увеличивается, причем этот процесс занимает меньше 1 с. Когда кровь достигает легких, начинается диффузия СО2 в атмосферу. При этом под действием карбоангидразы в эритроцитах происходит массовое превращение Н2СО3 в СО2 и Н2О. Этот процесс в свою очередь является движущей силой для переноса аниона бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СО2 и Н2О.

Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na+, вместе с НСО3 - был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НСО3 - переносит в обратном направлении анион Сl-. Такая челночная система работает очень быстро.

2. Переносчики как ферменты: применение теории скоростей

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных транспортных систем. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии (рис.1) соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения К mах, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков.

Рис.1

3. Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков

Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы.

Рис.2

Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика:

1) белок обращен внутрь/связан с субстратом;

2) обращен внутрь/не связан;

3) обращен наружу/ связан с субстратом;

4) обращен наружу/не связан.

Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий. Субстрат связывается с участком, обращенным к одной стороне мембраны (определяемой как цис-сторона). Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии (например, энергии гидролиза АТР). Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны (определяемой как транс-сторона). Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к транс-стороне мембраны. Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к цис-стороне.

Ключевым моментом в работе всех переносчиков является наличие высокого энергетического барьера, для преодоления которого соответствующие белки должны претерпеть конформационные изменения. Если для этого необходима энергия, то система может работать как активный переносчик (пример - Са2 + - насос, транспортирующий ионы Са2+ за счет энергии гидролиза АТР). Если для конформационного перехода необходимо, чтобы молекула переносимого вещества была связана с белком, т.е. стадия 4 отсутствует, то белок будет катализировать только обмен вещества через биослой, поскольку он не может изомеризоваться в "незагруженной" форме (пример - белок полосы 3 эритроцитов). Кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, но ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.

4. Анализ стационарного состояния

Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой (цис → транс), то также и возвращаться обратно (транс → цис). Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

1. Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны (цис). Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик (пермеаза) должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию [S] цис для процесса, протекающего в любом направлении (например, для переноса вещества внутрь везикул или для выведения его из везикул).

Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка - только с одной стороны (цис). В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Из меряют поток как функцию [S].

Меченый субстрат находится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной (транс) стороне. Измеряют поток как функцию [S] цuc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток (цис→ транс). Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.