Кинетику транспорта с помощью пермеазы изучали, используя подходы:

1) выведение лактозы по градиенту или транспорт в везикулы (нуль с транс-стороны);

2) активный транспорт лактозы против градиента концентрации, сопряженный с протонным электрохимическим градиентом;

3) равновесный обмен;

4) противоток (бесконечность с цис-стороны).

1. Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно - для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к периплазматической и цитоплазматической сторонам мембаны, и соответствующий конформационный переход является лимитирую щей стадией процесса. Максимальная скорость транспорта равна 25-50 с-1. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала (ДДН+) Км для лактозы составляет - 80 мкМ; место связывания протона, возможно, характеризуется высоким рКл, поэтому большую часть времени протонировано.

При ДДН+ = 0 значение Км для лактозы гораздо выше - 15-20 мМ.

2. Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н+ со стехиометрией 1:

3. Конечным результатом транспорта является перенос через бислой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал и разность протонного химического потенциала.

6. Несколько примеров активных переносчиков, использующих энергию атр и фосфоенолпирувата

Есть несколько замечаний, касающихся первичных активных переносчиков. Охарактеризовано довольно много систем, с помощью которых происходит сопряжение транспорта тех или иных веществ через мембрану с гидролизом макроэргической фосфатной связи или с другой реакцией, в ходе которой высвобождается энергия.

Как уже отмечалось, в основе кинетических моделей многих первичных активных транспортных систем лежит концепция чередования конформационных изменений. При этом совершенно необязательно, чтобы реакция, в ходе которой высвобождается энергия, например реакция гидролиза АТР, была прямо сопряжена с конформационным переходом, необходимым для транспорта; важно лишь, чтобы такое сопряжение существовало с одной или несколькими стадиями кинетического цикла. Требования, предъявляемые к структуре трансмембранного "канала" первичного активного переносчика, аналогичны таковым для других переносчиков, но здесь возникает дополнительная сложность - необходимость контроля сопряжения химической реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта растворимого вещества.

О молекулярной структуре первичных активных транспортных систем известно даже меньше, чем о транспортных белках, обсуждавшихся ранее в этой главе. Идентифицировать группы родственных переносчиков, близких по строению и механизму работы, помогают данные об их аминокислотной последовательности, которых становится все больше. Однако достоверные данные о том, каково строение участков, непосредственно вовлеченных в транспорт веществ, отсутствуют. В основе различного рода структурных моделей активных переносчиков лежит предположение о том, что трансмембранный канал, через который транспортируются вещества, образован кластером трансмембранных амфифильных α-спиралей. Сходным образом и модели, описывающие сопряжение химических реакций и транспорта веществ, опираются на весьма немногочисленные экспериментальные данные. Модели сопряжения можно разделить на две главные группы. Согласно модели прямого сопряжения, химическая реакция оказывает непосредственное влияние на перенос транспортируемого вещества, причем этот процесс не требует значительных опосредованных белком конформационных изменений. Например, протоны, участвующие в гидролизе АТР, могли бы быть именно теми ионами, которые транспортируются через мембрану в ходе данной реакции. Для этого необходимо, чтобы участок комплекса, где протекает химическая реакция (например, гидролиз АТР), и участок связывания транспортируемого вещества были расположены очень близко друг к другу. В отличии от этого модели непрямого сопряжения химическая реакция оказывает влияние на транспортный процесс через опосредованные белком конформационные изменения. Допускается даже, что химическая реакция и активный транспорт могут быть связаны с разными субъединицами внутри комплекса. Эти модели имеют то преимущество, что с их помощью нетрудно объяснить транспорт различных веществ (например, Na+, Н +) одними и теми же или близкородственными белками при участии одних и тех же механизмов.

Активные транспортные системы функционируют со скоростями, типичными для многих ферментов, т.е.102-103 с-1 в условиях насыщения. В отличие от канальных белков селективность в отношении субстрата обусловливается главным образом сродством транспортируемого вещества к активному переносчику. Более того, большинство первичных активных переносчиков обычно функционирует в условиях, когда концентрация переносимого вещества с цис-стороны близка или немного превышает Км и лимитирующей стадией транспорта является конформационный переход белка или химическая реакция, служащая источником энергии для данной системы.

И наконец, роль первичных активных транспортных систем заключается в перемещении вещества через мембрану против его концентрационного градиента в одном направлении (цис → транс). Поскольку переносчик после высвобождения транспортируемого вещества должен опять изменить свою ориентацию с транс на цис, необходим какой-то механизм, препятствующий возвращению на цис-сторону загруженного переносчика (т.е. обратному транспорту вещества). Следовательно, сродство активного переносчика к транспортируемому веществу должно быть/ выше с цис-стороны (где этот субстрат при низких концентрациях связывается с переносчиком), чем с транс-стороны (где оно диссоциирует при гораздо более высоких концентрациях). Если бы это было не так, переносчик работал бы очень неэффективно при высоких концентрациях субстрата с транс-стороны. В такой реакции энергия затрачивается главным образом на изменение сродства переносчика к транспортируемому веществу. Например, ёние Na+ /К+ - АТР-азы или Са2+ - АТР-азы при помощи АТР ведет к стабилизации конформации тех переносчиков, у которых место связывания ионов обращено наружу и которые имеют низкое сродство соответственно к Na+ или Са2+. В то же время связывание АТР стабилизирует ту форму Na+/К+ - АТР-азы, в которой места связывания ионов, обращенные к цитоплазме, имеют низкое сродство к К+. Следовательно, механизм сопряжения реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта, катализируемого активными переносчиками, лучше всего рассматривать исходя из термодинамических принципов, т.е. как временную стабилизацию определенных конформаций и изменение сродства к транспортируемому веществу.

Можно выделить пять групп переносчиков, которые используют свободную энергию макроэргической фосфатной связи для осуществления транспорта веществ, т.е. природа нашла несколько путей решения этой задачи.

6.1 Переносчики катионов плазматической мембраны (е1e2-типа): атр-зависимые ионные насосы