Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработана среда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержит ами­нокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – даже жирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в раз­личных лабораториях. При том, что роль многих ком­понентов сложных сред до сих пор не была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты.

CO2-ИНКУБАТОР

Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO3 в воздухе при тем­пературе 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условия соблюдаются при использовании CO3-инкубаторов, поддерживающих необходимую температуру, влаж­ность и уровень CO2 в камере. Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа из баллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды. Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицин­ским стандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая угле­кислый газ, азот и кислород в нужной пропорции.

Влажность в камере CO3-инкубаторов поддержива­ется постоянным испарением воды со дна камеры ли­бо из специального лотка. Также в некоторых совре­менных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух, позволяющая автоматиче­ски поддерживать влажность в камере до 90%.

В связи с высоким уровнем влажности в инкубато­рах высок риск роста бактерий и плесени, поэтому не­обходима регулярная очистка всех поверхностей ка­меры. Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать это надо с большой ос­торожностью, поскольку известно негативное влияние этилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ

Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе с фоллику­лярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulus oophorus (яйценосный буго­рок) представляет собой часть фолликулярного эпите­лия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессе фолликулогенеза. Помимо прочего фоллику­лярная жидкость содержит фибриноген, что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколь­ко минут после аспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложно обнару­жить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используются два основных подхода:

1. Фолликулярную жидкость просматривают под ми­кроскопом сразу после аспирации и найденные ооци­ты незамедлительно помещают в среду для отмывки.

2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду с гепарином, предотвращаю­щую образование кровяных сгустков.

Как правило, в большинстве лабораторий руковод­ствуются вторым подходом. При этом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 мл добавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрацию гепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин не оказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона. Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательно отмывают в специальной среде.

После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает в эмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается на присутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирок переливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопом или инвер­тированным микроскопом при небольшом увеличе­нии. Как правило, комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистые комки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см.

Найденные ооциты помещаются в среду для отмыв­ки, содержащую HEPES-буфер, позволяющий мани­пулировать с ооцитами на воздухе без риска измене­ния рН в щелочную сторону (такие среды производят­ся большинством фирм, специализирующихся на про­изводстве сред для ЭКО), затем отмываются в культуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальную чашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооци­тов и культивирование эмбрионов.

Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды, покрытых слоем мине­рального масла, предварительно эквилиброванного с культуральной средой в присутствии 5% С02. Преиму­ществами культивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральную среду мик­роорганизмов и частичек пыли, возможность культи­вирования в небольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшой концентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испаре­ния воды и выхода CO2 из среды вне инкубатора. Одна­ко, если капли со средой под маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходному равновесию влажности и концентрации CO2 займет гораздо больше времени, чем в отсутствие масла.

Манипуляции с ооцитами проводят с помощью от­тянутых стерильных пастеровских пипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклян­ных (пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют и другие способы ма­нипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зави­сит от опыта и желания эмбриолога.

Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценить количество, качество и сте­пень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus.

Классификация комплексов ооцит-cumulus,

применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж