Сразу после слияния гамет ядерная мембрана спер­матозоида разрушается, хроматин деконденсируется под влиянием факторов ооплазмы. Одним из этих фак­торов, возможно, является так называемый фактор деконденсации ядра сперматозоида (SNDF). Ооцит также активируется, мейоз возобновляется, выделяет­ся второе полярное тельце. Механизм активации ооци­та пока изучен недостаточно, однако известно, что фактор активации выделяется сперматозоидом. Ядерный материал ооцита окружается оболочкой - формируется женский пронуклеус. Вокруг хрома­тина сперматозоида формируется мужской пронукле­ус, в обоих пронуклеусах идет синтез ДНК. Мужской и женский пронуклеусы начинают движение по на­правлению друг к другу и встречаются в центре ооци­та. Через несколько часов после встречи мембраны пронуклеусов разрушаются, и генетический материал обеих гамет сливается (сингамия). На этом этапе про­цесс оплодотворения завершается - возникает зигота. Хроматин зиготы конденсируется, и хромосомы подго­тавливаются к первому делению дробления.

На следующий день после аспирации ооциты пере­носят в лунку со свежей культуральной средой и очи­щают от клеток лучистого венца пастеровской пипет­кой с оттянутым до диаметра 150 - 160 мкм кончиком и просматривают на предмет присутствия признаков оплодотворения. Пронуклеусы видны в ооците даже при наблюдении в стереомикроскоп х 80. Они появля­ются, как правило, через 10 - 16 ч после добавления сперматозоидов в среду с ооцитами и исчезают через 6 - 8 ч после появления. Если присутствуют оба пронуклеуса - оплодотворение считается нормальным. Если их не удается обнаружить - оплодотворение не состоялось. Если виден один пронуклеус либо больше двух - произошло аномальное оплодотворение.

Примерно в 30% случаев в ооцитах после оплодо­творения in vitro не выявляются пронуклеусы, что мо­жет быть связано как с несостоявшейся пенетрацией ооцита (низкая концентрация активных сперматозои­дов, дефекты в механизмах адгезии сперматозоида, отсутствие рецепторов на zona pellucida и/или мембра­не ооцита), так и с незрелостью ооцита на момент оп­лодотворения, а также с наличием хромосомных ано­малий у ооцита (диплоидия, анеуплоидия).

При наличии в ооплазме одного пронуклеуса (около 3 - 6%) в половине случаев оплодотворение все же происходит, однако пронуклеусы формируются асин­хронно. Происхождение таких зигот может быть раз­личным: гиногенетическим (из ооцита), андрогенетическим (из сперматозоида) либо возникшим в резуль­тате слияния мужского и женского пронуклеусов. Отличить на практике это невозможно, поэтому реко­мендуется: во-первых, просматривать ооциты на сле­дующий день после инсеминации несколько раз, чтобы избежать ошибки; во-вторых, не переносить в полость матки эмбрионы, полученные из однопронуклеарных зигот.

Полипронуклеарные зиготы - 3 и более пронукле­усов - составляют, как правило, 5 - 10% от всех оп­лодотворенных ооцитов и возникают главным образом при проникновении в ооцит более одного сперматозо­ида (в случае добавления избыточного количества сперматозоидов при инсеминации, при дефектах кор­тикальной реакции, при незрелости или перезрелости ооцита). Также описаны случаи неотделения второго полярного тельца после завершения мейоза, генетиче­ский материал которого формирует третий пронукле­ус. Полипронуклеарные зиготы, как правило, не развиваются нормально, эмбрионы, полученные из таких зигот нельзя переносить в полость матки. В естественных условиях такие эмбрионы иногда имплантируются, однако чаще всего такая беременность заканчивается выкидышем либо мертворождением.

Рис. 4. Яйцеклетки и зародыши человека на различных этапах культивиро­вания.

а – ооцит с первым полярным тельцем; б – пронуклеусы: в и г – зародыши на ста­диях 4 и 8 бластомеров. Микрофотографии живых объектов в фазовом контрасте.

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ

Эмбрионы, полученные после оплодотворения ооцитов одной и той же пациентки, часто отличаются по скорости дробления и морфологическим парамет­рам. Общепризнанным считается, что максимальную способность к имплантации имеют эмбрионы с наи­большей скоростью дробления, бластомеры которых имеют регулярную форму, а безъядерные фрагменты отсутствуют. Такие эмбрионы относят к классу 1 (А). Градация эмбрионов по качеству является условной и различается в разных лабораториях. Однако в ос­нове ее лежит, как правило, характер фрагментации эмбриона, форма и размер бластомеров. Так, эмбрион с неравными бластомерами и/или фрагментами ци­топлазмы, занимающими менее 10% объема, соответ­ствует классу 2 (В); при наличии фрагментации 10 - 50% - классу 3 (С), более 50% - классу 4 (D).

Работы по анализу влияния качества переносимых в полость матки эмбрионов на частоту их имплантации многочисленны, но трудносопоставимы в силу разных методик оценки качества. Около 20% переносимых эмбрионов А-В класса имплантируются, однако эта частота падает до 1,5% для сильно фрагментированных эмбрионов. Впечатляют результаты клиники Bourn Hall (Англия), в которых показано, что 90% пациенток, забеременевших после ЭКО и ПЭ, по­лучали при переносе эмбрионов хотя бы один эмбрион класса А. В той же работе не было выявлено зависимо­сти между качеством переносимых эмбрионов и часто­той невынашивания беременности.

СТРАТЕГИЯ ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ

Количество переносимых эмбрионов обычно со­ставляет не более 2 - 3, поскольку при увеличении чис­ла эмбрионов до 4 и более частота беременности, как правило, не возрастает, но увеличивается риск моногоплодной беременности, что влечет за собой серьез­ные проблемы акушерского характера. Однако в от­дельных случаях допускается перенос большего числа эмбрионов - при многократных неудачных попытках ЭКО и ПЭ и при возрасте пациентки старше 40 лет. В данном случае при последующих переносах шанс наступления беременности снижается, и авторы пытаются использовать возможность наступления бе­ременности за счет увеличения количества переноси­мых эмбрионов. Но такой подход не является науч­ным, так как в этих случаях не всегда ясна причина неудач, т. е. мы часто имеем дело с так называемым «бесплодием неясной этиологии».

Что касается интервала между моментом оплодо­творения ооцитов и временем переноса эмбрионов, то здесь существует несколько основных подходов. На заре развития метода Эдварде и Стептоу переносили в полость матки эмбрионы, достигшие стадии 8 - 16 бла­стомеров на 3 - 4-е сутки культивирования, имитируя естественные условия. Однако впоследствии было выявлено, что более ранние эмбрионы также пригод­ны для переноса и имплантируются с той же вероят­ностью.

Через 48 ч после аспирации фолликулов (2-е сутки культивирования) эмбрионы, как правило, находятся на стадии 2 - 4 бластомеров, но встречаются и стадии 6 - 8 бластомеров. Перенос эмбрионов на 2-е сутки наи­более общепринят: уже имеется возможность отобрать эмбрионы по качеству и скорости дробления, однако пребывание в условиях культуры, являющихся в лю­бом случае менее оптимальными, чем естественные, еще не слишком длительно.