Для исследования влияния липидов на мембранные ферменты применяется еще одна стратегия - так называемый метод смешанных мицелл. Фермент растворяют в детергенте, не активирующем его, и к смеси добавляют липиды. Многие мембранные ферменты сохраняют определенную активность и в детергенте, причем такая активность сильно зависит не только от природы фермента, но и от выбранного детергента, а также, возможно, от наличия эндогенных липидов в препарате очищенного фермента. Вообще говоря, для метода смешанных мицелл желательно полностью освободить фермент от липида, однако для этого иногда приходится использовать весьма грубые процедуры, которые могут привести к денатурации белка. Методы полного обезжиривания обычно основаны на пропускании препарата фермента через среду с большим избытком детергента. Для этого используют гель-фильтрацию, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или связывание фермента с каким-либо твердым носителем с последующим промыванием избытком детергента.

Метод смешанных мицелл имеет еще и то преимущество, что липофильный субстрат можно добавить в мицеллах того же детергента, хотя в этом случае могут возникнуть трудности, связанные с пространственным разделением фермента и субстрата. Наблюдаемые в такого рода системах эффекты липидов являются преимущественно аллостерическими, поскольку здесь нет бислоя, а связывание липидов с белком происходит в глобулярной мицелле в присутствии большого количества детергента. К сожалению, физическое состояние комплекса фермент-детергент-фосфолипид определить практически невозможно, и это серьезный недостаток описываемого подхода.

Любые эффекты, наблюдаемые в такой системе для какого-либо липида, должны быть получены с использованием нескольких не активирующих фермент детергентов. Только в этом случае можно быть уверенным, что детергент нейтрален. К сожалению, такие работы встречаются не часто.

Результаты исследования многих систем позволяют сделать несколько общих выводов.

Для активации фермента очень редко бывает необходим липид с какой-то строго определенной структурой. Безусловно, одни липиды активируют данный фермент с большей эффективностью, чем другие, однако такое предпочтение может зависеть от условий измерения, а уж говорить о его физиологическом значении как минимум преждевременно. Вполне может оказаться, что липид, с высокой эффективностью активирующий фермент, вообще не присутствует в мембране, из которой этот фермент выделен. Поэтому к утверждениям о специфичности липида следует относиться с. осторожностью.

Измеряемая в системе со смешанными мицеллами зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации липида обычно свидетельствует о высокой кооперативности процесса. Такое поведение можно объяснить, в частности, тем, что липиды связываются некооперативио с несколькими эквивалентными центрами на ферменте, но активными являются только те молекулы фермента, у которых занята большая часть липидсвязывающих центров. Нередко при активации фермента липидом наблюдается оптимум в концентрационной зависимости, вероятно связанный с достижением определенного соотношения между липидом и детергентом и образованием в такой смеси конкретных структур.

Сама по себе бислойная структура не является необходимой для активации ферментов, поскольку многие ферменты проявляют активность в присутствии детергента или в составе липидио-детергентных мицелл. Известны случаи, когда мембранные ферменты эффективно активируются липидами, вообще не формирующими стабильные бислои.

Важным параметром, определяющим активность большинства мембранных ферментов, безусловно является физическое состояние бислоя. Однако четких данных о физиологической регуляции ферментативной активности с помощью этого параметра in vivo нет. При переходе липидов в фазу геля многие ферменты становятся неактивными либо их активность резко уменьшается. В литературе есть масса примеров, когда изменения скорости работы фермента с температурой коррелировали с изменением физического состояния липидов. В этих работах основное внимание обращалось на корреляцию между точками перегиба в температурных зависимостях ферментативной активности и какой-либо характеристикой, отражающей физическое состояние липида. Выявить связь ферментативной активности с вязкостью мембраны, исходя из температурной зависимости, весьма непросто, поскольку температура влияет одновременно на очень многие параметры. Следует иметь в виду, что вязкость мембраны в значительной степени коррелирует с плотностью упаковки молекул липида в бислое, и индуцируемые температурой изменения вязкости можно объяснить в основном изменениями в плотности упаковки. Существует очень немного примеров четкой линейной корреляции между активностью фермента и вязкостью мембраны. Неясно, правда, как интерпретировать эту корреляцию с точки зрения механизма ферментативной реакции. И лишь в нескольких работах содержатся указания на то, какая или какие из стадий ферментативной реакции являются лимитирующими и модулируются связыванием липида. В связи с этим необходимо упомянуть, что липиды могут сильно влиять не только на максимальную скорость, но и на связывание фермента с субстратами и кофакторами.

Вообще говоря, при исследовании взаимодействия с определенным ферментом большого числа разных липидов корреляции между активностью фермента и каким-либо одним параметром не наблюдается. Пока липид находится в жидкокристаллическом состоянии, для ферментативной активности часто более важна структура полярной головки липида, чем вязкость бислоя. Другими словами, важна химическая структура индивидуальных липидов, а почему - это уже отдельный вопрос.

4. Некоторые примеры липидзависимых ферментов

Рассматриваемые ниже пять ферментов выбраны в качестве примеров потому, что, во-первых, они лучше всего изучены и охарактеризованы; во-вторых, они охватывают несколько типов мембранных ферментов; в-третьих, они могут служить иллюстрацией нескольких основных проблем, возникающих при исследовании липидзависимой активации.

4.1 0-гидроксибутиратдегидрогеназа

Это один из наиболее хорошо изученных активируемых липидом ферментов и единственный фермент, обладающий абсолютной специфичностью к определенному липиду: активировать БДГ способен только фосфатидилхолин. БДГ локализуется на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и катализирует окисление /3-гидроксибутирата с помощью NAD+. Оба субстрата водорастворимы. Молекулярная масса субъединицы фермента равна 31 кДа, но ее аминокислотная последовательность до конца не установлена. БДГ скорее всего не является трансмембранным белком. Получаемый после очистки фермент свободен от фосфолипида и детергента и способен спонтанно встраиваться в фосфолипидные везикулы. Хотя БДГ связывается и с везикулами, не содержащими Фосфатидилхолина, каталитическую активность фермент начинает проявлять только в присутствии фосфатидилхолина. При встраивании фермента в везикулу, по-видимому, происходит не только взаимодействие с поверхностью мембраны, но и значительное погружение белка в бислой, а также изменения конформации белка. Кинетические свойства фермента и его тетрамерной формы одинаковы в митохондральной мембране и после реконструкции с митохондриальными липидами.